方法学验证方法

方法学验证方法

内容提要：（方法学验证的应用、依据、类型、一般参数、要求）

验证应用：方法验证是对测定方法的评价，是建立新方法的研究内容和依据。

（新建方法、已建立方法的修订验证、已建方法的复现）

验证依据：方法应用领域对方法验证要求的“指导原则”

验证类型：全部验证Fall validation、部分验证Partial validation、交叉验证cross validation

●Full validation：第一次新建方法；一个已建方法，但增加分析对象（精密、回收）。

●Partial validation：（已建方法的部分改变）

1)分析方法改变（检测器改变）；

2)生物样品（抗凝剂改变）；

3)基质改变（血－尿）；

4)前处理方法改变；

5)生物样品种属改变（rat大鼠－mouse小鼠）；

6)仪器改变工作软件改变；

7)稀有生物样品，取样量有限。

●Cross validation：样品分析在不同场所或实验室进行时，不同实验室需进行加样生物样品或

实际样品分析，建立实验室间的重现性数据。当分析数据由不同检测技术产生时 LC－MS vs ELSD 需交叉验证

部分验证：准确度，精密度（都做）

交叉验证：加样准确度，实际样品分析（任一）

一般参数：

精密度precision:

同一匀质样品的一组测量值，彼此符合的程度。

1)SD 标准偏差 standard deviation

2)％RSD 相对标准偏差relative SD， CV 变异系数 n>8

标准差 SD=开方（求和（xi－x均值）/（n－1））

％RSD＝SD/x均值×100％

●日内精密度（intraday precision）：同一次测定，7～10份，按方法做。测定，SD值，RSD

限度（生物制品5％，药品2％）。

●日间精密度（interday precision）：不同一次测定，7～10份，按方法做。测定，SD值，RSD

限度（生物制品15％，药品5％）。

准确性accuracy：

●结果与真值的接近程度，表示分析方法测定的正确性，通常用回收率实验表示（加样回收率）。

●回收率＝（测定液测定值－原样液含测值）/加入量值×100％

灵敏度：

●检测限（limit of detection LOD）：分析方法能从背景信号中区分出药物，所需样品中药物

的最低浓度，LOD反映方法与仪器的灵敏度和噪音也表明样品经处理后本底值的高低。S/N>3●定量限（limit of quantitation LOQ）在保证具有一定可靠性（一定准确度和精密度）分析方

法能够测定出样品中药物的最低浓度。反映分析方法测定含药物的低浓度样品时的可靠性。

选择性（selectivity）：

分析方法从其他成分中区分并定量目标成分的能力

●专属性（specificity）：指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号

●选择性（selectivity）：指一种方法可对多种成分产生不同响应，主要成分响应可与其他成

分区分

选择性的区分选择内容：

⏹化药：杂质、降解产物、相关化合物、制剂辅料（可通过空白比较和添加法所得分析结

果比较确定）

⏹体内药物：内源性物质、代谢物、分解产物、分析中的相伴物、内源性代谢物

⏹体内药分的选择性内容：空白生物样品（血尿、胆汁等）、至少六个来源的生物样品（非

MS方法）、每个空白样品均测定干扰和LOQ。

线性（liner）：

●给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力

●线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且呈线性的供试

物浓度的变化范围其最大、最小量间的间隔。

●浓度范围包括5-8个浓度点，标准曲线应覆盖样品浓度范围。

1.药物一般80-120%（但低限不低于LOQ）

2.体内药物、浓度上线高于样品最高浓度，下限为LOQ

3.相关系数(r) 表示了线性度r≧0.9900

重现性（Repeatibility）

相同方法在正常条件下多次重复测定同一匀质样品所得分析结果的重现程度。

稳定性（Stability）

●生物样品中药物的稳定性涉及储存条件、药物理化性质、基质、容器系统。

●Stability评价包括：样品收集与前处理、短期储存、长期储存、冻融、处理后稳定性。

稳定性试验要求

●Stability考察条件应反映实际测定过程的实验条件。

●应包括Stocking solution稳定性的考察

●冻融稳定性至少高、中、低三个浓度、三个冻融过程在真实实验条件下保存样品，室温化

冻，至少保存24小时，第二、三次相同条件下至少保存12-24小时，在第三个circle时分析。

●如果样品不稳定，应在-70℃下保存

●短期稳定性：样品化冻后室温4-24小时考察稳定性

●长期稳定性：应包括第一样品—>最后样品分析结束的全过程（三个浓度、足够样品）

处理后稳定性

分析过程 ~~~ 一个方法经建立、验证、正常应用后进行分析。

分析包括：标准溶液配制、分析法与过程建立、验证后方法应用与建立分析结果认可的标准。药物定量方法：LC、GC、生化免疫、同位素标示。

验证要求：

1.标准曲线至少6个点，包括LLOQ（标准曲线最低浓度）、ULOQ（最高浓度）Upper limit

of quantification

2.精密度precision和准确度accuracy：三个浓度，每个浓度进样5次，测定与理论差≤

15% 、LLOQ外≤20%。三个浓度的分布要求：lowQC sample=3*LLOQ middleQC=中间

点 highQC 接近曲线最高点

3.稳定性：2个浓度的三次冻融（每个2次？）生物样品的室温稳定性、处理后的稳

定性。

分析数据的可接受标准

1.标准曲线除LLOQ，CV在15%以内

2.QCsample在分析过程中合理分布

3.QCsample至少67%--> <15% 最多33%--> >15%可接受

4.每样品周期中QC样品至少5%

中药指纹图谱方法验证评价标准 CSV图谱?

参数：精密度、重现性、稳定性

方法：相似度软件

要求：相似度>0.9 or 0.95

建立实验室的SOP标准操作规程

SOP标准操作作业书

SOP内容：原始记录保存试剂安全仪器样品传递过程控制

设备样品标签质量控制方法结果保证