分子生物学-5基因治疗
分子生物学和生物化学在疾病治疗中的应用
分子生物学和生物化学在疾病治疗中的应用疾病，是人类在生命过程中总会遇到的一件事情。
而对于疾病治疗的要求，则是每一个患者都非常迫切的。
随着科技的不断进步，分子生物学和生物化学的发展也为疾病治疗提供了越来越多的工具和方法，大大改善了患者的生存质量和治疗效果。
一、分子生物学在疾病治疗中的应用1. 基因治疗基因治疗是通过向人体内部注入或修复适当的基因来达到治疗疾病的目的。
基因治疗技术的关键在于寻找到正确的基因和正确的途径来将这些基因送入人体细胞。
一些基因治疗在实验室中已经获得了成功且安全的结果，比如通过基因治疗来治愈免疫性缺陷病（SCID）的疑似患者、治愈舌癌等。
但是，目前基因治疗只在相对少数的疾病治疗中被使用，这为人体基因治疗的安全性和有效性都带来了一定的不确定性。
2. 蛋白质药物蛋白质药物已成为新型治疗疾病的重要手段，由于蛋白质药物可以根据具体疾病与患者进行相应调整，以达到最佳的治疗效果。
此外，蛋白质药物的产生成本比化学药物更高，也更容易产生不稳定和副作用等风险。
因此，在蛋白质药物的研究和开发中，分子生物学技术显得尤为重要。
而随着生物信息和高通量技术的发展，分子生物学界也不断在寻找、挖掘和筛选出更多可用于药物研发的蛋白质，以满足更多疾病治疗需求。
二、生物化学在疾病治疗中的应用1. 药物化学合成药物的化学合成是生物化学应用的主要领域之一。
通过化学合成，人们可以对目标化合物进行定向的改造和合成，以达到更好的治疗效果。
例如，双氢青蒿素、阿司匹林等高效药物在生物化学合成领域有着非常广泛的应用。
2. 药物代谢学药物代谢学是一门关于化学药物在患者体内代谢的学科，对于疾病治疗也有着非常重要的影响。
在药物代谢学中，人们通过分析药物进入人体的途径、在人体内传播的方式、以及与其他物种之间的相互作用等方式来研究药物的相互关系，并为制定最佳的治疗方案提供了试验数据和分析结果，从而有效降低治疗过程中的风险和副作用。
3. 酶学酶学是生物化学和分子生物学和中极具实用价值的一个分支学科。
分子生物学实际应用例子
分子生物学实际应用例子
基因治疗是利用分子生物学技术，将正常基因导入病变细胞或组织，以修复或替代缺陷基因的治疗方法。
例如，对于遗传性疾病，基因治疗可以通过改变患者的遗传物质来治疗病症。
2. 重组蛋白生产
利用分子生物学技术，可以将不同来源的基因组合成一个新的基因，从而产生重组蛋白。
重组蛋白被广泛应用于医药、食品、农业等领域。
例如，利用重组蛋白可以生产人类生长激素、胰岛素等药物。
3. 基因工程作物
通过基因工程技术，可以将具有特定性状的基因导入植物基因组中，从而改变植物的性状，使其具有更好的抗病性、耐旱性等特点。
例如，转基因玉米可以抵抗玉米螟虫侵害，转基因水稻可以提高产量。
4. DNA指纹鉴定
DNA指纹鉴定是利用分子生物学技术，比较不同个体或物品的DNA序列，以确定它们的亲缘关系或来源。
DNA指纹鉴定被广泛应用于刑事侦查、亲属关系鉴定等领域。
5. 疾病诊断
分子生物学技术可以用于疾病的诊断。
例如，PCR技术可以检测感染病原体的DNA/RNA，从而诊断感染性疾病；基因测序技术可以检测遗传病变的基因突变，从而诊断遗传性疾病。
总之，分子生物学技术在医学、农业、环境保护等领域的应用广泛，为我们的生活带来了诸多便利。
研究生入学考试专业课现代分子生物学-5
研究生入学考试专业课现代分子生物学-5(总分：100.00，做题时间：90分钟)一、论述题(总题数：24，分数：100.00)1.HIV是通过攻击人体内T4-淋巴细胞，使人体的免疫系统遭到破坏而致病的。
能不能对艾滋病患者进行定时输入通过基因工程产生的特定T4-淋巴细胞而延长生命?主要存在哪些技术上的障碍?（分数：4.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：暂时不能。
T4-淋巴细胞于骨髓中生成，然后在胸腺内分化成熟，成熟后移居于周围淋巴组织中，是特异性免疫的中枢细胞。
目前基因工程手段主要是改善细胞的生化代谢特性，通过基因工程手段操作后再在动物细胞生物反应器中进行培养，而T4-淋巴细胞形成和成熟分别在不同的组织环境，培养比较困难。
基因工程产生的细胞，注入不同个体，细胞表面抗原物质会使个体对其产生排斥，正常功能的的T4-淋巴细胞输入人体后能否移住于周围淋巴组织也是需要解决的问题。
2.人类为防治HIV做了大量的工作，但是HIV用高的变异速度以逃避人体的免疫系统和药物，为什么HIV 的变异如此之快?HIV的变异有无规律?主要在哪些方面发生变异?（分数：4.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：HIV发生变异的主要原因是其自身的逆转录酶缺乏校对功能，不能及时切除错误引入的核苷酸，大约每次复制循环中可发生一个错误而导致随机变异，而HIV有很强的复制能力，这样就会产生大量病毒的变种；其次由于宿主的免疫选择作用，体液或细胞免疫的基因组变异高于其他部位；此外，不同病毒DNA 之间，病毒DNA与宿主DNA间的重组也是病毒变异的原因之一。
分子生物学
第一章绪论1.基因治疗：利用基因工程的技术，在基因水平上纠正有缺陷的基因，用来治疗人类遗传性疾病。
2.细胞分化：从受精卵开始的个体发育过程中，后代细胞间在形态、结构和生理功能上发生差异的过程为细胞分化。
3.干细胞：具有分裂和分化潜能的细胞称为干细胞，干细胞再适合的条件下可分化成不同类型的细胞群（全能性，多能型，单能性）4.分子诊断：利用分子生物学的手段（如：PCR、限制性酶切、克隆、核酸杂交等）对多种疾病，特别是遗传性的疾病作出早期诊断的技术，即分子诊断。
5.NA多态性：同一种群的不同个体在同源染色体的相同位置会有不同的序列特（如：不同拷贝的短串联重复序列）6.DNA指纹是指所有能够进行个体识别的DNA多态性（片段）的组成。
7.分子生物学的三条基本原理：构成生物有机大分子的单体在不同生物中都是相同的；生物体内一切有机大分子的建成都遵循着各自特定的规则；某一特定生物体内所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。
第二章原核基因表达调控1.DNA的一级结构：就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。
2.双螺旋的基本特点是：1）DNA分子是由两条平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。
2）DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内测。
3）两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。
3.一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes（基因组）。
4.Genotype（基因型）：The genetic constitution of a given organism（指某个特定生物体细胞内的全部遗传物质）。
5.Phenotype（表现性）：Visible property of any given organism（某个特定生物体中可观察道德物理或生理现象）。
6.Mutations（突变）：染色体DNA中可遗传的核苷酸序列变化。
7.着丝粒（Centromere）：是细胞有丝分裂期间纺锤体蛋白质与染色体的结合位点（attachment point）。
分子生物学 总结---病毒载体
基因工程与基因治疗的比较：1、概念：基因工程是将具有价值的目的基因，装配在具有表达元件的特定载体中，导入相应的宿主如细菌、酵母或哺乳动物细胞中，在体外进行扩增，经分离、纯化后获得其表达的蛋白产物。
基因治疗是将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，直接进行表达。
2、进行基因治疗时无需对表达产物进行分离纯化，因为人细胞本身可以完成这个过程。
3、基因工程的“目的基因”主要是可分泌蛋白，如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体等。
基因治疗不受以上限制，几乎所有的基因，只要其具有治疗作用，均可应用于基因治疗。
4、基因工程的操作全部在体外完成，基因治疗则必须将基因直接导入人体细胞。
途径：1、ex vivo：将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）细胞，这种细胞被称为基因工程化的细胞，经体外细胞扩增后输回人体。
2、in vivo：将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。
基因治疗中的病毒载体应具备的条件：1、携带外源基因并能装配成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体没有致病力。
（使其成为复制缺陷型病毒并删除致癌基因）分类：1、重组型病毒载体：以完整的病毒基因组作为改造对象，在不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件的情况下，有选择性地删除病毒的某些必须基因，尤其是前早期或早期基因以控制其表达，所缺失的必需基因的功能由同时导入细胞中的外源基因表达单元提供，一般通过同源重组方法将目的基因插入到病毒基因组中。
2、无病毒基因的病毒载体：重组载体+辅助系统重组载体主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必须的顺式作用元件及载体骨架组成。
辅助系统包括病毒复制和包装所必须的所有反式作用元件。
在辅助系统的作用下，重组载体以特定形式（单链或双链DNA或RNA）被包装到不含有任何病毒基因组的病毒颗粒中。
优点：载体病毒本身安全性好，容量大。
分子生物学在疾病治疗中的应用
分子生物学在疾病治疗中的应用随着科学技术的不断进步，分子生物学已经成为疾病治疗领域的重要工具。
分子生物学的应用为疾病的预防、诊断和治疗提供了新的思路和方法。
本文将从疾病防治的角度讨论分子生物学在疾病治疗中的应用。
一、基因治疗基因治疗是利用基因工程技术将正常基因导入患者体内，以修复或替代损坏的基因。
基因治疗可以用于治疗遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病等。
通过将正常的基因导入患者体内，可以纠正患者身体内缺陷的基因，从而实现治疗目的。
此外，基因治疗还可以用于治疗某些癌症，如CAR-T细胞治疗。
二、药物研发分子生物学在新药研发中起着重要作用。
通过分子生物学的技术手段，可以深入了解疾病的分子机制，找到新的治疗靶点。
例如，结合基因测序技术和蛋白质组学技术，可以发现与疾病相关的基因和蛋白质，从而为新药的研发提供依据。
此外，分子生物学在药物筛选和药物开发过程中也起到重要的作用，可以通过构建细胞模型和动物模型，评估药物的疗效和毒副作用。
三、免疫治疗免疫治疗是指通过调节或增强机体免疫系统的能力，达到治疗疾病的目的。
分子生物学技术在免疫治疗中发挥了重要作用。
例如，单克隆抗体技术可以制备具有特异性的抗体，用于抗肿瘤、抗感染等治疗。
此外，分子生物学技术还可以用于增强免疫细胞的抗原递呈能力，提高免疫治疗的效果。
四、细胞治疗细胞治疗是指利用活体细胞作为药物，用于治疗疾病。
分子生物学技术在细胞治疗中发挥了关键作用。
例如，干细胞技术可以用于修复损伤组织，如心肌梗死后的心肌再生。
此外，分子生物学技术还可以用于改造细胞，使其具有特定的功能，如CAR-T细胞治疗。
综上所述，分子生物学在疾病治疗中发挥了重要作用。
基因治疗、药物研发、免疫治疗和细胞治疗等应用都为疾病的防治提供了新的思路和方法。
随着分子生物学技术的不断发展，相信在未来会有更多的创新性治疗方法出现，为人类健康作出更大的贡献。
分子生物学名词解释
1.医学分子生物学:应用分子生物学的技术和手段，结合现代医学技术，从分子水平研究人体正常状态和疾病状态下生命活动及其规律2.基因(gene) 是一段携带功能产物〔多肽，蛋白质，tRNA和rRNA和*些小分子RNA〕信息的DNA片段，是控制*种性状的的遗传单位。
3.密码子偏爱〔codon bias 〕:指在不同物种的基因中经常为*种氨基酸编码的只是其中的一个密码子。
4.基因的剪接位点〔splice sites〕:一般有特定的序列特征，计算机程序利用这种序列特征可预测将近50%的外显子及20%的完整基因。
5.C值佯谬〔C value parado*〕：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象。
N值佯谬〔N value parado*〕：基因组中基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性6.基因组〔genome〕：是指一个细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质.〔〕7.基因家族(genefamily):指核苷酸序列或编码产物的构造具有一定同源性的一些基因。
〔04〕8.基因超家族〔 gene superfamily〕：构造上具有一定的相似性，但功能不一定相似，且进化上的亲缘关系较远。
如免疫球蛋白基因超家族、丝氨酸蛋白酶基因超家族等〔05〕9.基因组学(genomics)：开展和应用基因作图、 DNA测序、基因定位等新技术以及计算机程序，分析生命体〔包括人类〕全部基因组构造及功能10.微卫星DNA〔microsatellite DNA〕：或称简短串连重复，由2~6个核苷酸的重复顺序组成，如(CA)n、(GA)n、(TA)n，n为15~30具有多态性，卫星长度常小于100bp，大量分布每条染色体11.小卫星DNA〔minisatellite DNA〕：由6~12个核酸的重复顺序组成，位于染色体端粒及其附近，长度数十~数千bp12.大卫星DNA〔macrosatellite DNA〕：即经典的卫星DNA，由数十个核苷酸的重复单位构成，主要存在于异染色区和着丝粒。
分子生物学技术在基因工程中的应用
分子生物学技术在基因工程中的应用分子生物学技术是基因工程中重要且不可或缺的工具，它在基因工程研究和应用中扮演着至关重要的角色。
分子生物学技术的进展不仅推动了基因工程领域的快速发展，也带来了许多重要的应用，包括基因治疗、基因诊断和基因编辑等。
首先，分子生物学技术在基因工程中的应用之一是基因治疗。
基因治疗是一种通过向患者的细胞或组织中引入正常的基因来修复缺陷基因的方法。
分子生物学技术为基因治疗提供了许多关键工具，如重组蛋白质表达系统、载体构建和基因传递技术等。
其中，重组蛋白质表达系统是基因治疗的关键步骤之一。
分子生物学技术通过DNA重组技术，将目标基因插入到真核或原核的表达系统中，使其能够高效表达出功能蛋白质。
重组蛋白质的高效表达为基因治疗提供了充足的物质基础，进一步促进了基因治疗的研究和临床应用。
另外，基因治疗中的载体构建也离不开分子生物学技术的支持。
载体是将目标基因导入到宿主细胞中的工具，通常是通过改造病毒或质粒来构建。
分子生物学技术的发展使得载体的构建更加简便和高效，例如利用限制性内切酶和DNA连接酶进行酶切和粘性末端连接，进而实现载体的快速构建。
此外，基因传递技术也是基因治疗的重要一环，它负责将修复的基因导入到患者的细胞或组织中。
常用的基因传递技术包括病毒介导转染和非病毒介导转染。
分子生物学技术不仅改良了病毒载体的构建和改造，提高了病毒介导转染的效率和安全性，还发展了一系列的非病毒载体，如脂质体、聚合物和金属离子介导的传递系统等。
除了基因治疗，分子生物学技术在基因工程中的另一个重要应用是基因诊断。
基因诊断是一种通过检测DNA或RNA上的变异来识别遗传性疾病或个体的遗传特征的方法。
分子生物学技术在基因诊断中扮演着关键的角色，如聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）和DNA测序等。
聚合酶链反应是一种扩增目标DNA片段的方法，它可以从极少量的样本中扩增出足够的DNA，以便进行后续的分析。
分子生物学技术在肿瘤基因诊断和治疗中的应用
分子生物学技术在肿瘤基因诊断和治疗中的应用在现代医学中，分子生物学技术的应用越来越广泛，特别是在肿瘤基因诊断和治疗中的应用更是引起了人们的广泛关注。
通过对肿瘤的基因信息进行分析，可以为医生提供更准确的诊断和治疗方案，从而提高治疗效果和患者的生存率。
一、基因诊断分子生物学技术在肿瘤基因诊断中的应用主要包括PCR技术、FISH技术、CGH技术和基因芯片技术。
其中，PCR技术是常见技术之一，通过扩增肿瘤细胞的基因特征片段，从而可以检测出肿瘤细胞中的突变、拷贝数变异等信息，进而判断肿瘤的类型、分级和预后。
FISH技术则可以在细胞水平上探测染色体的异常，例如肿瘤细胞中的染色体重排和拷贝数变异。
CGH技术则可以全基因组扫描，检测出它们的基因组重排和拷贝数变异。
基因芯片技术则可以通过检测大量的基因表达情况，来确定患者肿瘤的类型和预后。
二、基因治疗除了基因诊断，分子生物学技术在肿瘤基因治疗中也有着广泛的应用。
已经有多种基因治疗方法被提出，例如基因敲除、基因替换、RNA干扰及基因表达修饰等。
其中，基因敲除是通过RNA干扰技术针对癌细胞中表达的抗凋亡蛋白进行靶向敲除，从而降低癌细胞的生存能力。
以目前的研究为例，许多研究人员已经成功地利用RNA干扰技术下调了多个癌细胞中抗凋亡蛋白的表达，并且这种方法的疗效优于传统的抗癌药物治疗。
此外，在基因替换方面，已经有许多研究人员通过介导肿瘤细胞和正常细胞间的相互作用来降低肿瘤细胞的增殖和生存能力。
例如，利用OncoVEX GM-CSF病毒载体抑制的肿瘤细胞没有实现完全消灭，但已经证明它对于辅助治疗是有效的。
三、基因修饰基因表达修饰也是一种常见的基因治疗方法。
这种方法通过调节患者体内特定基因的表达水平，从而调节肿瘤细胞的增殖和生存能力。
例如，已经有研究人员发现通过将外源microRNA引入癌细胞可以有效地抑制癌细胞的增殖，从而降低肿瘤在患者身上的复发率。
总之，分子生物学技术在肿瘤基因诊断和治疗中的应用，为医生和患者提供了更加准确和可靠的治疗方案，特别是在传统治疗难以有效的病例中，拥有更为突出的优势和作用。
分子生物学名词解释
三、名词解释基因工程：在体外应用人工方法进行基因重组，然后把重组的基因导入宿主细胞，进行复制、转录及翻译的过程。
PCR技术：针对插入重组体中的目的基因，设计一对引物，进行菌落PCR，如能扩增出条带，则为阳性克隆。
限制性核酸内切酶：识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
基因工程载体：供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或(和)复制的运载工具。
重组DNA技术：重组DNA技术简单概括为：“分、切、接、转、筛”1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体互补DNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成的与mRNA互补的DNA。
四、问答题1、简述基因工程的基本程序。
基本程序目的基因的获得（DNA片段）(分、切）↓DNA片段与载体基因的连接（体外重组）（接）↓连接产物（重组体）导入宿主细胞（转）↓重组体的扩增、筛选与鉴定（筛）↓目的基因在宿主细胞中的表达↓表达产物的分离纯化2、简述基因工程技术在医学上的应用。
（一）疾病基因的发现与克隆（二）生物制药（三）基因诊断（四）基因治疗（五）遗传病的预防三、名词解释1、受体：（receptor）细胞膜或细胞内的一些天然分子，能够识别和结合有生物活性的化学信号物质（配体，liganal）,从而启动一系列信号转导，最后产生相应的生物学效应。
2、G蛋白：是一种鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白，一般是指与细胞表面受体偶联的异三聚体G蛋白。
3、MAPK:MAPK 通路是多种促增殖信号在细胞内信号转导的共同通路。
MAPK 的上游激酶MAPKK 或MEK 是一个DSPK，它能使MAPK 分子中的Thr 185 和Tyr 187 磷酸化而使该酶激活。
4、第二信使：细胞内的化学信号----第二信使5、PTK：酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase, PTK ）是一类能催化蛋白质酪氨酸残基(tyr或Y)磷酸化的蛋白激酶，共同特征是所极端具有典型的PTK结构域，该酶可催化自身或底物磷酸化。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因， • 胞嘧啶脱氨酶在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶 （5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。 • 5-氟尿嘧啶通过竞争性抑制胸苷酸合酶的活性， 从而抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。
2. 旁观者效应
旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导 了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死， 而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细 胞也被杀死。
Packaging：作为病毒 RNA基因组被装配成新的 病毒颗粒
Everything is ready!
Packaging
• 2 RNAs in 1 virus
HIV 从受感染细胞的质膜出芽的情形
逆转录病毒的产生包括将RNA包装到衣壳中， 然后从细胞的细胞膜上得到部分膜，出芽释放。
Genome Structure of Retrovirus
世界上第一个正式被批准用于基因 治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症。 1990年9月美国Blaese博士成功地将 正常的人的ADA基因植入ADA缺乏症病人 的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗 试验。
腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的 严重联合免疫缺陷(SCID)
第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)
(1)在U3内有增强子和启动子； (2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； (3)在R内还有poly(A)加尾信号。
逆转录病毒前病毒的结构特点
（3）病毒有三个结构基因 (1)gag基因，编码核心蛋白；
(2)pol基因，编码逆转录酶和整合酶；
(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括 外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 （4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的包装信号序列 （ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。
逆转录病毒整合入宿主DNA中的分子机制，其本质是转座
LTR(long-terminal repeat): 长末端重复序列
Provirus(原病毒): 被整合到细胞基因组中的逆 转录病毒序列
3 forms
Two fates of RNA:
Translation:作为mRNA
翻译成病毒的蛋白质
5 辅病毒
LTR 目的基因 标记基因 LTR
Gag蛋白 PoL蛋白 Env蛋白
包装细胞系
靶细胞
假病毒颗粒的产生并感染靶细胞
逆转录病毒载体的特点
①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许 多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。
②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响 其他部分的活性。 ③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于 外源基因在靶细胞中的永久表达。 ④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病 毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清 液中，易于分离制备。
1. 2. 3. 4.
外源基因可有效导入靶细胞 外源基因能在靶细胞中长期稳定存留 导入基因能适量表达 导入基因的方法及载体对宿主细胞安全 无害
二、基因转移技术
The Technique of Gene Transfer
基因治疗途径
• 1、间接体内治疗途径（ex vivo)
• 是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体 外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外 源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩 增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、 易控制但操作复杂）
• 病因: • 淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积
治疗策略： 淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10% 维持免疫系统功能
破坏免疫功能
患儿很少活到成年
改善病人症状
治疗基本步骤:
ADA基因+逆转录病毒载体 导入患者淋巴细胞 体外扩增 回输病人体内 淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状
• 病毒颗粒中有逆转录酶
• 能整合于宿主细胞的染色体
逆转录病毒颗粒结构
gp41 gp120
包膜
逆转录酶 基质蛋白
RNA 衣壳蛋白
Lifecycle of retrovirus
Reverse transcription Integration Transcription Packaging
pol
env
Vector DNA
rRV particles
Retroviral vector pakaging system: Virus producing cells, VPC
逆转录病毒载体
LTR
φ
目的基因 标记基因
1
LTR
重组逆转录病毒 (核酸部分只能是逆转 录病毒载体)
4
3
2
LTR gag pol env LTR
一、基因治疗的策略
The Strategy of Gene Therapy
（一）基因臵换（gene replacement）
定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通 过定位重组，以导入的正常基因臵换基因组内原 有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复， 不涉及基因组的任何改变。
逆转录病毒载体的主要缺点
随机整合，有插入突变、激活癌基 因的潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能 容纳7 kb以下的外源基因。
（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体
腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。 它通过受体介导的内吞作用进入细胞内， 腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未 发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感 染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。
AAV Virus Particles
Structure of AAV Virus Genomic DNA
3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。
(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同 源重组； (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺 病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。
4.靶向性差。
（3）腺病毒相关病毒载体
• 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus， AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。 • 其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20 面体颗粒。 • AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、 单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制 和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
（五）基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因 导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌 免疫反应。
二、基因治疗的必要条件
1. 发病机制在DNA水平上已经清楚； 2. 要转移的基因已经克隆分离，其表达产 物有详尽的了解； 3. 该基因正常表达的组织可在体外进行遗 传操作；
理想的基因治疗还必须：
长末端 重复序列 正常的病毒基因
LTR
Байду номын сангаас调节和 启动转录
gag
pol
env
LTR
核心蛋白质 (Nucleoprotein core) 编码逆转录 酶和整合酶(integrase)
编码病毒外壳 蛋白质(Envelope)
逆转录病毒前病毒的结构特点
（1）两端各有一长末端重复序列LTR。 （2）LTR由U3、R和U5三部分组成。
• 2、直接体内治疗途径（in vivo）
• 将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体 必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简 单但疗效短、免疫排斥等）
基因治疗的两种途径
ex vivo
靶细胞
载体 目的基因
in vivo
基因转移(gene transfer)技术：
1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。
基因同源重组技术
• 又称为基因打靶(gene targeting） • 定点整合的条件:转导基因的载体与染色 体上的DNA具有相同的序列。带有目的 基因的载体就能找到同源重组的位点，进 行部分基因序列的交换，使基因臵换这一 治疗策略得以实现。
• 要实现基因臵换，需要采用同源重组技 术使相应的正常基因定向导入受体细胞 的基因缺陷部位。 定向导入的发生率约1/100万，采用胚 胎干细胞培养的方法，这种同源重组的 检出率最高可达1/10。
构成逆转录病毒介导的基因转移系统
——逆转录病毒载体由两部分组成：
(1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋 白基因
(2) 辅助细胞株(如PA317)：它由缺陷型 逆转录病毒感染构建而成
Retroviral packaging system
PA317 cell gag
LTR Pro therapeuticgene LTR
1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高， 因此它也是使用最多的基因治疗载体。 据统计，有72%的临床实验计划和71%的 病例使用了病毒载体，其中用得最多的 是逆转录病毒载体。
（1）逆转录病毒（Retroviruses） • 具有包膜，圆球状，直径为80~120nm
• 基因组是单正链RNA，3.5~9.0kb
生殖细胞(germline) 基因治疗
2.基因治疗发展简史
• 1990年9月14日：第一例正式批准的基因治疗 实验开始进行 • （美国，世界上开展基因治疗最早的国家） • 大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶 段： 体外试验和动物试验 I期临床试验——6---10名志愿者 II期临床试验——20---30名志愿者 III期临床试验——充分分析疗效、安全性 中国：1991年7月开始进行基因治疗试验