番茄miRNA的茎环qRT-PCR方法验证
miRNA研究方法
miRNA研究方法miRNA主要研究技术深度测序抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。
深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（mi RNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。
通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。
miRNA芯片利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。
与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRN A进行研究。
筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。
q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。
前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。
(欧易生物为您提供以上项目的优质服务，详情请关注：)Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA 研究也不例外。
通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA 及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。
萤光素酶报告系统在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。
通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。
番茄转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将外源基因导入番茄植株，实现特定性状的表达，并研究转基因番茄的生长发育、生理特性和抗病性等方面的变化。
二、实验材料1. 番茄植株：品种为“中蔬5号”。
2. 外源基因：目的基因（如抗病基因、抗虫基因等）。
3. 载体：pGEM-T载体。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶等。
5. 试剂：植物细胞培养试剂、抗生素等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆（1）设计引物，针对目的基因进行PCR扩增。
（2）将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。
（3）挑选阳性克隆，进行测序鉴定。
2. 番茄植株的转化（1）将目的基因与载体构建成重组质粒。
（2）采用农杆菌介导法将重组质粒导入番茄植株。
（3）筛选阳性植株，进行PCR和Southern blot检测。
3. 转基因植株的筛选与鉴定（1）采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株。
（2）对转基因植株进行抗性筛选，如抗病、抗虫等。
4. 转基因植株的表型分析（1）观察转基因植株的生长发育、生理特性和抗病性等方面的变化。
（2）对转基因植株进行产量、品质等指标测定。
四、实验结果1. 目的基因的克隆成功克隆了目的基因，并进行了测序鉴定。
2. 番茄植株的转化成功将重组质粒导入番茄植株，获得了转基因植株。
3. 转基因植株的筛选与鉴定通过PCR和Southern blot检测，证实了转基因植株的存在。
4. 转基因植株的表型分析（1）转基因植株的生长发育与对照植株无明显差异。
（2）转基因植株在抗病性、抗虫性等方面表现出显著的优势。
（3）转基因植株的产量和品质与对照植株相当。
五、讨论与分析1. 本实验成功将目的基因导入番茄植株，并获得了转基因植株，为研究转基因番茄的性状表达提供了基础。
2. 转基因植株在抗病性、抗虫性等方面表现出显著的优势，表明基因工程技术在农业生产中具有广泛的应用前景。
3. 实验结果表明，转基因番茄的生长发育、生理特性和抗病性等方面与对照植株相当，说明转基因技术对番茄的性状影响较小。
miRNA常用实验方法
miRNA常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的realtime-PCR检测方法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计方法：1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。
通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。
因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。
3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。
一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。
2、miRNA反转录miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。
因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。
我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补至10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。
Stem-LoopmiRNAqPCRPrimerUseGuide
茎环miRNA qRT-PCR 检测使用说明一．概述microRNA(miRNA)是生物体内未编码的单链小分子RNA，其成熟体主要通过跟mRNA的3’UTR 区域结合，导致mRNA降解或表达抑制来行使其生物学功能。
miRNA 在生物体内主要有三种不同的存在状态：刚在细胞核内转录并加工成的初级状态，Primary-miRNA（Pri-miRNA）；Pri-miRNA经过Drosha等酶剪切后形成的约80nt的茎环状结构, Precursor-miRNA（Pre-miRNA）；真正行使生物学功能的约22nt的成熟体，Mature-miRNA(我们常简称为miRNA)。
现阶段最特异、最经济的miRNA qPCR检测方法即为采用茎环引物反转录再配合SYBR Green qPCR检测试剂盒来进行，该技术主要两个步骤（）：(1). 基于茎凸环结构的反转录引物进行特异miRNA的反转录；（2）.基于经济的SYBR Green qPCR试剂进行快捷的检测反应。
茎凸环结构的反转录引物能与特异miRNA的3’端结合，在RT酶的作用下开始进行特异行反转录反应, 然后再配合特异的miRNA正向引物及反向通用引物来实现对特异miRNA进行定量检测，其检测原理示意图如图1所示：图1. 茎凸环-SYBR Green qPCR miRNA检测原理示意图二．配套试剂iScript cDNA Synthesis Kit: Cat# 1708890, 1708891 (BIO-RAD)iTaq Universal SYBR Green Supermix ：Cat# 1725120, 1725121, 1725122, 1725124 (BIO-RAD) 三．检测流程引物的准备1. 引物融解：收到订购或合成回的miRNA引物实物后，需在离心机上12000 rpm 离心2 min，使其引物粉末完全到达离心管底部，轻柔的打开盖子，按每1nmol引物中加入20ul的灭菌去离子水(如是RT引物，建议用DEPC水进行融解)至50μM，其即为引物使用母液，涡旋震荡混匀后可在-20 ℃长久保存2. 用于RT反应的茎凸环引物使用反应液的配置：在正常情况下，一个RT反应可至少同时进行1-45个茎环引物的反转录，即一次RT可同时反转录该样品中至少1-45个miRNA，从而实现高通量的检测。
microRNA实时定量茎环RT-PCR的技术
microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术摘要：已开发出一种新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR 分析。
茎环RT引物在RT 效率和特异性方面比传统的更好。
TaqMan miRNA的检测是很具体的，可以检测成熟miRNA和区分相关的甚至低至一个核苷酸的miRNAs。
此外，他们不会受到基因组DNA污染的影响。
精确量化可以从低至25皮克的总RNA中提取大多数miRNA。
事实上，这种方法灵敏度高，特异性强和精密度高，允许无需核酸纯化，直接分析单个细胞。
如标准TaqMan基因表达分析，TaqMan miRNA的检测显示出了7个数量级的动态范围。
七个小鼠组织中五个miRNA定量显示，在每个细胞中，有低至10到超过30000个拷贝数。
这种方法可以确保快速，准确，灵敏miRNA表达谱，并能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。
茎环RT-PCR可用于其他小RNA分子，如短干扰RNA（siRNAs）的量化。
此外，为更好的特异性和效率，茎环RT引物设计的概念可以应用在小分子RNA 克隆和多重检测。
引言：miRNA是自然发生的，高度保守的转录家庭，来源于较大的发夹前体。
miRNA是在动物和植物的基因组上发现的。
到目前为止，有1000个独特的转录产物，其中，在桑格中心miRNA的注册表中包括326人类miRNA。
miRNA是通过催化mRNA的分裂或抑制mRNA的翻译来调节基因表达。
他们被认为在细胞发育，分化和传导中发挥着重要作用。
具体职责包括调节细胞增殖和新陈代谢，发育时间，细胞死亡，造血，神经发育，人类肿瘤形成与DNA甲基化和染色质修饰。
虽然miRNA的相对丰富的转录产物类别，其表达水平在物种和组织之间相差很大。
低丰度的miRNA经常逃避检测技术，如克隆，Northern杂交和基因芯片分析。
这里，我们提出一种新型实时定量方法，能够准确灵敏地检测miRNA与其他小分子RNA。
microRNA qRT原理
microRNA qRT-PCR引物套装是包含了miRNA特异的逆转录引物，以及PCR正反向引物。
通常样本采用U6作为miRNA检测的内参，适用于单个和多个样本不同miRNA的定量分析。
根据目的miRNA设计独特茎环和加poly(A)结构，提供人源、大鼠源以及小鼠源miRNA的逆转录引物及定量PCR 引物，引物具有灵敏度高，可特异地结合miRNA分子并且具有更好的稳定性，检测范围广，能有效地扩增待检测样本。
(1) Stem-loop miRNA qRT-PCR
利用特殊的茎环结构反转引物在SYBR Green荧光染料或TaqMan探针的作用
下检测miRNA。
图1.Stem-loop miRNA qRT-PCR检测试剂的实验流程图。
利用特殊的茎环结构反转引物
在SYBR Green 荧光染料或TaqMan探针的作用下检测miRNA
(2) 加Poly(A)尾miRNA qRT-PCR
在成熟的miRNA的3‘端加poly（A）尾后，通过带通用序列的poly(T)引物反
转延伸，在SYBR Green 荧光染料的作用下PCR检测反转录形成的miRNA。
图2.加Poly(A)尾miRNA qRT-PCR检测试剂盒的实验流程图
在成熟的miRNA的3’端加poly(A)尾后
通过poly(T)引物反转延伸，在SYBR Green荧光染料的作用下PCR检测反转录形成的miRNA
miRNA引物验证
1、反应条件均一，灵敏度高。
2、可检测少量样本中的成熟的miRNA。
3、方便，经济，覆盖面广，重复性好。
4、高特异性和灵敏度确保了结果的可靠性和重复性。
番茄果实高质量总RNA的提取富集及RT-PCR检测
０ 引 言
番 茄 （ ｏ ｎ ｍ ｌｅｐｒｉ ｍ Ｌ ） 属 茄 科 草 本 植 Ｓｌ ｕ ｙｏ ｅｓ ｕ ． ａ ｃ
多 糖等 手段 ， 成熟 的 番 茄果 实 组 织 中提取 出 了高 质 从
量 的 总 Ｒ Ａ，同时 利 用 Ｌｃ 沉 淀 法 的富 集 作 用 获得 Ｎ ｉ ｌ 高 浓度 的总 Ｒ Ａ和 内参基 因 的 ８一ａｔ பைடு நூலகம் ｃｎ的 Ｒ ｉ Ｔ—Ｐ Ｒ Ｃ
异 丙 醇 联 合 沉 淀 的 方 法 除 去 多 糖 ， 良 了 Ｔｉ ｌ 。 为 了 检 验 含 量 比 较 低 的 ｍｉＮ 利 用 Ｌｃ 沉 淀 的 方 法 进 行 富 改 ｒｏ 法 ｚ Ｒ Ａ， ｉｌ
集 。结 果表 明 ： 良 Ｔｉ ｌ 能 够有 效 地去 除 多糖 ， 取 到 的 Ｒ Ａ ２ Ｓ ｒＮ 改 ｒｏ法 ｚ 提 Ｎ ８ Ｒ Ａ亮度 约 为 １ Ｓｒ Ｎ 的 ２倍 ， ２ ０与 Ｒ Ａ ８ Ａ６ Ａ８ ２ ０比值 为 １ ８ Ａ ６ ． ４， ２ ０与 Ａ２ ０比值 为 １ ９ Ｒ Ａ产 率为 ３ ０ ４ ｐ ／ ， 明利 用 改 良 Ｔｉ ｌ ３ ． ２， Ｎ ５ ． ￣ ｇ 说 ｇ ｒｏ 法从 番 茄果 实 中提 ｚ
１ 材 料 与方 法
１ １ 材料 和试剂 ． １ １ １ 材 料 ．．
取 番茄 品种 “ 中蔬 ４号 ” 绿熟 期果 肉新鲜 组 织 ， 经 液 氮速 冻后 存储 于 一 ８ ＝ 箱保 存备 用 。 ０ｃ冰 Ｉ
１ １ ２ 实验试 剂和处 理方法 ．．
代 谢产 物 的影 响 Ｊ 。所 以 ， 在 急 需 一种 能 够 有 效 去 现 除该类 物质 影 响 的优 化 方法 。ＭｉｒＲ Ａ 是分 子 生 物 ｃｏ Ｎ ｓ
２１ ０ １年 ３月
检测miRNA方法
检测miRNA方法
检测miRNA的方法主要有以下几种：
1. Northern blotting（北方印迹法）：通过RNA电泳分离和迁移，然后使用探针结合miRNA进行检测。
2. qRT-PCR（实时定量逆转录聚合酶链反应）：利用逆转录将miRNA转录为cDNA，然后使用PCR进行定量检测。
3. Microarray技术（芯片技术）：将已知的miRNA探针固定在芯片上，通过杂交检测待测miRNA。
4. Next-generation sequencing（下一代测序）：利用高通量测序技术，将小RNA转录本进行测序，然后通过比对和统计分析来确定miRNA的存在和表达水平。
5. 免疫细胞化学染色：利用抗体和荧光标记来检测miRNA的表达和定位。
6. 探针法：通过使用与目标miRNA互补的标记探针来检测miRNA。
这些方法各有优缺点，选择合适的方法需根据实验目的、预算、样本量等因素综合考虑。