RACE cDNA反转录说明书
RACE试验流程
RACE一．第一链合成，总RNA 10ng—1ug 反转录1．准备如下5’和3’—RACE-Ready cDNA反应管，量多加1管，以下10ul体系。
2．5×First-strand Buffer 2.0ulDTT 1.0ulDNTP Mix 1.0ulTotal V olume 4.0ul2.另外管准备如下5’和3’反应液5’RACE Ready cDNA 3’RACE Ready cDNA1.0-2.75ul RNA1.0-3.75ul RNA1.0ul 5’-CDS PrimerA1.0ul 3’-CDS PrimerA3.在第二步中加灭菌水（ddH2O）使5’RACE Ready cDNA 终体积为3.75ul，3’RACE Ready cDNA终体积为4.75ul4.混匀及短暂离心5.在PCR仪上72℃温育3min，42℃2min，冷却后14000离心20s，收集下部液体（这部可预备step7：Marster Mix）6.5’RACE Ready cDNA加1ulSMATⅡoligo7.准备足够Master Mix为5’ 3’RACE合成，室温顺序混匀以下反应液：Buffer Mix （from step1）4.0ulRNA inhibitor（400V/ul）0.25ul SMARTseribe TM Reverse Transcriptase（100V） 1.0ulTotal V olume 5.25ul8.将step7的Master Mix加到step5的3’—RACE—Ready cDNA和step6的5’终体积10ul9.移液枪吸打混匀，短暂离心收集与管底10．42℃温育90min（热盖PCR仪）11.70℃，10min12.用Tricine-EDTA Buffer稀释第一链反应产物总RNA≤200ng，加20ul Tricine—EDTA bufferRNA≥200ng，加100ulPolyA RNA，加250ul13.-20℃≤3 months。
RACE2说明书
bd smart? race cdna amplification kit user manual i. 简要概述ii. 成分列表control human placental total rna 和 bd smart ii a oligonucleotide在–70°c下保存。
nucleotrap gel extraction kit 室温下保存。
其余试剂–20°c下保存。
随bd smart race cdna amplification kit 同时免费提供bd powerscript reversetranscriptase和bd advantage 2 pcr kit。
所有试剂可以满足7 次cdna 合成反应和30次pcr反应。
first-strand cdna 合成?7μl bd smart ii? a oligonucleotide (12 μm) 5–aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg–3 ? 7μl 3-race cds primer a (3-cds; 12 μm) 5–aagcagtggtatcaacgcagagtac(t)30v n–3 (n = a, c, g, or t; v = a, g, or c) ? 7μl 5-race cds primer (5-cds; 12 μm) 5–(t)25v n–3 (n = a, c, g, or t; v = a, g, or c) ? 7μl bd powerscript? reverse transcriptase ? 200 μl 5x first-strand buffer 250 mm tris-hcl (ph 8.3)375 mm kcl30 mm mgcl2 ? 200 μl dithiothreitol (dtt; 20 mm) ? 1ml deionized h2o5- & 3-race pcr? 400 μl 10x universal primer a mix (upm) long (0.4 μm):5–ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagag t–3short (2 μm):5–ctaatacgactcactatagggc–3 ? 50 μl nested universal primer a (nup; 10 μm) 5–aagcagtggtatcaacgcagagt–3 control reagents? 5μl control human placental total rna (1 μg/μl) ? 25 μl control 5-race tfr primer (10 μm) ? 25 μl control 3-race tfr primer (10 μm) general reagents? 70 μl dntp mix (datp, dctp, dgtp, and dttp, each at 10 mm) ? 2 x 1 ml tricine-edta buffer 10 mm tricine-koh (ph 8.5) 1.0 mm edtanucleotrap? gel extraction kit (cat. no. 636053 or k3070-y) ? 100 μl nucleotrap suspension? 3 ml nt1 buffer? 10 ml nt2 buffer? 2ml nt3 buffer? user manual (pt3169-1) free trial-size bd advantage? 2 pcr kit (cat. no. 639207 or k1910-y) the bd advantage 2 kit provides sufficient reagents for 30 pcr reactions. ` ` ? 30 μl 50x bd advantage 2 polymerase mix ? 200 μl 10x bd advantage 2 pcr buffer ? 50 μl 50x dntp mix (10 mm each) ? 30 μl control dna template (100 ng/μl) ? 30 μl control primer mix (10 μm each) ? 1 ml pcr-grade water ? user manual (pt3281-1) iii. 另备物品下列试剂需另外准备：? 0.5-ml pcr 反应管，推荐使用 perkinelmer geneamp 0.5-ml reaction tubes (cat.no. n801-0737 or n801-0180).? mineral oil (e.g., sigma cat. no. m-3516) iv. bd smart race的要点使用前请全面阅读?所有参数均经过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。
cDNA末端快速扩增技术RACE
♥ 技术背景 ♥ 基本RACE 原理和方法 ♥ 样品要求 ♥ RACE 产物的鉴定和全长
cDNA 的获得
技术背景
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法列标签(express
sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 用cDRNNAa末se 端保快护速、扩S1增核(R酸A酶C谱E)和技引术物。延
3′端。
RACE流程
（1）
GSP 与 cDNA 模板的关系
cDNA 末端快速扩增(RACE) 技术。
cDNA RACE cDNA synthesis Kit原理 poly(C)替代poly(A) 增加模板中有效双链丰度
RNase H
5′-RACE法
利5′-用RAOCli（Ego法2(d）T) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ，
利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。
用RNase 保护、S1 核酸酶谱和引物延
RACE 产物的3′和5′
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法：
SMART RACE cDNA synthesis Kit
SMART RACE cDNA synthesis Kit
基本RACE 原理和方法
与通用引（物4的）3’-末端不互补
样品要求：
◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入 液氮中速冻或加入样品稳定剂。
◇ Total RNA无降解，OD260/280=1.8 ~ 2.0。
◇ 提供尽量多的实验材料：3′ RACE Total RNA＞ 15 μg；5′RACE Total RNA＞25 μg。如果基因 的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应 增加。
RACE
RACE第一RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
Mei5bio M5 HIPER
Mei5Biotechnology,Co.,Ltd:(86)-010-********,*****************,Mei5bio Inc. All rights reserved.M5 HIPER ™ RACE cDNA Synthesis Kit 使用手册（请使用低吸附枪头）Cat.# MF670-01 10T （12.5ul 体系）完整的5‘和3’c D N A 末端简便的一管两步法程序低至50 n g 总R N A或25 n gp o l y A + R N ARACE cDNA Synthesis Kit使用手册目录I.简介 (2)II.HIPER™ cDNA 合成技术 (2)III.操作简述 (4)IV.HIPER™试剂盒组分 (6)V.注意事项 (7)VI.引物设计 (8)VII. 总RNA和m RNA制备与处理 (10)VIII. 第一链cDNA合成 (11)IX. 快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE) (13)X. RACE产物鉴定 (15)XI. 常见问题及解决方案 (17)XII. 参考文献 (23)I.简介HIPER™ RACE cDNA合成试剂盒通过扩增基因的5'和3'末端精细、有效地完整克隆基因。
HIPER™ RACE方法可有效地在样品cDNA 5 '和3 '末端加入人工接头，尽可能地形成最完整的RACE产物。
反转录步骤后合成的第一链cDNA可直接用于5'和3' RACE PCR反应，无需再进行繁复的第二链cDNA合成和接头连接的过程。
其他RACE方法均因扩增的高背景和截短的5 '末端而存在明显的劣势。
优化后的方法既便是在样本很小的情况下，也可以显著降低非特异性的扩增，且只需单一PCR管和两步法的程序就可使您的RNA样品合成cDNA。
此外，HIPER™技术由于避免了接头连接的步骤，在RACE PCR过程中直接使用cDNA作为模板，从而降低了RACE的过程的复杂性，并使其更快捷（Chenchik et al，1998），操作时间更缩短至4个小时。
TAKARA公司的5' full RACE说明书
400 μl 100 μl 100 μl
For Control Reactions（5 次量）：
Control HL60 Total RNA（1 μg /μl）*2 5′RACE Control Outer Primer（10 μM）*2 5′RACE Control Inner Primer（10 μM）*2
引物序列（5’→ 3’） CATGGCTACATGCTGACAGCCTA CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG AGGTAGGTGATGTTCCGAGAGCGT TTGGAGTCGCCCTCAGCAGAGAT
长度 23 mers 34 mers 24 mers 23 mers
团。 3. 使用 T4 RNA Ligase 将 5′RACE Adaptor 连接到去帽后的 mRNA 上。 4. 以上述 3 的mRNA作为模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-），Random 9 mers
进行反转录反应合成cDNA。 5. 使用下游外侧特异性引物 GSP1 和 5′RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，再使用下游内侧
行 5′RACE 实验。 3． 高特异性的 5′RACE 扩增。套式 PCR 法的使用，大大提高了 5′RACE DNA 片段扩增的特异性。
4． 长片段 5′RACE扩增。试剂盒中使用了本公司特殊改良的M-MLV（RNase H-）反转录酶，反转录性
能良好，使长片段的RT-PCR扩增成为了可能。
●制品内容（10 次量）
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读！
1． 进行 5′RACE 实验时，为提高 RACE 结果的可信度，应同时进行 TAP（-）和 M-MLV（-）的负对 照实验。TAP（-）即：RNA 经去磷酸化反应后不进行 TAP 处理，直接进行 5′RACE Adaptor 的 连接及后续实验，以验证 RNA 去磷酸化是否充分。如果充分，RT-PCR 将不能扩增。但是，真正进 行 TAP（-）负对照实验时，由于不能保证 100%的去磷酸化，往往会有 RT-PCR 扩增结果，但其扩 增片段长度一般不同于目的片段。M-MLV（-）即：5′RACE Adaptor 连接反应后进行 RT 反应时 不添加 M-MLV，以排除基因组 DNA 污染造成的假阳性结果。如果 M-MLV（-）的负对照实验没有 特异性扩增，说明 5′RACE 结果来源于 mRNA。
RACE说明
TaKaRa Code：D3155’-Full RACE Kit(10次量)目录内容页码●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●试剂盒原理 2 ●特异性引物的设计要求 3 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 3 ●试剂盒使用注意 4 ●使用Control HL60 Total RNA时的5′RACE实验例 4 ●实验样品的5′RACE操作方法 8 ●实验例 11 ●Q&A 11●制品说明本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 5′末端全长的试剂盒。
使用RT-PCR方法扩增目的DNA时，一般很难得到全长的cDNA片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列十分重要。
RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效解决这一问题。
TaKaRa 5′-Full RACE Kit能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5′末端的全长序列。
本试剂盒应用了“去帽法”原理，Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）可以去掉mRNA的5′帽子结构，使用T4 RNA Ligase将5′RACE Adaptor连接到mRNA的5′端后，可以使用5′RACE Adaptor 上的引物与已知序列部分的引物进行RT-PCR反应，高特异性地扩增cDNA 5′末端的全长序列。
本试剂盒中含有完成5′RACE操作的主要试剂。
试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。
结合使用TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR扩增时，其5′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。
本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行5′RACE实验，并且对长片段的5′RACE扩增具有明显优势。
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。
这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。
RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。
3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。
•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。
•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。
•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。
5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
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RACE cDNA反转录说明书
1.准备cDNA合成反应液
2.0 ul 5×First-Strand Buffer
1.0 ul DTT (20uM)
1.0 ul dNTP Mix (10mM)
总共体积：4ul
2.准备以下试剂：
5’-RACE-cDNA: 1.0—2.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A
3’-RACE-cDNA: 1.0—3.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A
Control-cDNA: 只需要1ul mouse heart total RNA（1ug/ul）
3.加入H2O于上一步反应液至5’-RACE为3.75ul，3’-RACE为
4.75ul，然后轻轻吸打混匀。
4.放入PCR仪反应：72℃3min,
42℃2min
然后14000g离心10s。
5.对于5’-RACE-cDNA的合成，加入1ul SMARTerⅡA oligo至4.75ul。
6.配混合液： 4.0ul Buffer mix from step 1
0.25ul RNase inhibitor (40U/ul)
1.0ul SMARTScribe reverse transcriptase (100U)
总体积：5.25ul
7.将第6步混合液加入第2步微离心管中，使总体积达到10ul。
用枪轻轻吸打混匀。
8.42℃反应90min，然后70℃反应10min。
9.用Tricine-EDTA buffer稀释反应产物：
如果：起始RNA<200ng,加入20ul；
起始RNA>200ng,加入100ul；
Poly A+ RNA，加入250ul。
10. 将稀释好的cDNA模板保存于-20℃，最长时间达3个月。