反转录说明书
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
体外转录试剂盒说明书
使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上转录反应步骤和孵育1.解冻冷冻的试剂把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。
vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把2×NTP/CAP 放在冰上，10×reaction buffer保存在室温，所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。
2.室温下转录反应如果反应在冰上进行，10×reaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀，离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。
以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。
当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系(用0.1-0.2ug PCR产物模板或0-1ug线性质粒模板）对于更长或更短的转录，参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。
当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。
为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。
下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。
（对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。
对于SP6，为20mM.）应该添加多少额外的GTP?对于5-8KB的长度，我们建议最初测试加入1ul的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。
添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。
加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。
RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡在网织红细胞溶解物中，我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。
提取组织RNA,反转录,qPCR流程图
提取组织RNA,反转录,qPCR流程图⼀、Total RNA的提取：1.取出样本，放⼊灭过菌的研钵中，倒⼊液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，10min左右，研磨充分后加⼊1.5ml的EP管，加⼊1ml Trizol，充分匀浆。
（另⼀种，加⼊trizol会冻起来，就⼀直研磨，直到最后化成液体。
）2.室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中3.加⼊1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移⾄新管；4.加⼊等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min5.弃上清，留沉淀，加⼊1ml的75%⼄醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。
重复三次6.弃上清留沉淀，⾃然风⼲（5~10min），加⼊32ul DEPC处理过的⽔，测OD260/280的值，根据结果调整⾄1µg/µl=1000ng/µl，⽴即进⾏反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。
附：1OD260=40µg/ml⽤样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。
（可⽆）可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边⼀条不太明显的5SRNA的条带。
证明RNA完整⽆降解。
⼆、反转录：说明书：10 µl 反应体系可最⼤使⽤500 ng 的Total RNA。
20/1µg（以前⽤的40，下次⽤20）20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH20和enzyme 配成mix 5×PrimeScript Buffer（for Real Time）：4µlPrimeScript RT Enzyme Mix I ：1µlOligo dT Primer（50 µM）：1µlRandom 6 mers（100 µM）：1µl总RNA ：1µl(1µg/µl)RNase Free dH2O ：12µl反转录反应条件如下:37℃15 min （反转录反应）85℃5 sec（反转录酶的失活反应）4℃-20℃分装保存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）三、内参检测β-actin 50µl体系PCR 反应条件:扩增1 kb 的DNA ⽚段的PCR 反应条件如下：预变性：95℃，3min98℃10 sec.55℃30 sec.（下次60℃，去掉⾮特异性）72℃30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）72℃5min.4℃保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。
RACE cDNA反转录说明书
RACE cDNA反转录说明书1.准备cDNA合成反应液2.0 ul 5×First-Strand Buffer1.0 ul DTT (20uM)1.0 ul dNTP Mix (10mM)总共体积：4ul2.准备以下试剂：5’-RACE-cDNA: 1.0—2.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A3’-RACE-cDNA: 1.0—3.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer AControl-cDNA: 只需要1ul mouse heart total RNA（1ug/ul）3.加入H2O于上一步反应液至5’-RACE为3.75ul，3’-RACE为4.75ul，然后轻轻吸打混匀。
4.放入PCR仪反应：72℃3min,42℃2min然后14000g离心10s。
5.对于5’-RACE-cDNA的合成，加入1ul SMARTerⅡA oligo至4.75ul。
6.配混合液： 4.0ul Buffer mix from step 10.25ul RNase inhibitor (40U/ul)1.0ul SMARTScribe reverse transcriptase (100U)总体积：5.25ul7.将第6步混合液加入第2步微离心管中，使总体积达到10ul。
用枪轻轻吸打混匀。
8.42℃反应90min，然后70℃反应10min。
9.用Tricine-EDTA buffer稀释反应产物：如果：起始RNA<200ng,加入20ul；起始RNA>200ng,加入100ul；Poly A+ RNA，加入250ul。
10. 将稀释好的cDNA模板保存于-20℃，最长时间达3个月。
东盛生物 RT-PCR Kit（逆转录试剂盒） 说明书
0.6 μl RNasin , M-MLV ； 按下列条件进行反转录反应 42℃ 温浴 60 min（随即引物 37℃ 温浴 60 min） ； 5 终止反应 70℃ 温浴 5 min 终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃ 保存。 6 用 RNase-free ddH2O 将反应体系稀释到 50 μl ，取 2-5 μl 进行 PCR 扩增反应。
20 次逆转录反应，R1012 可进行 100 次逆转
录反应（20 μl 标准 PCR 反应体系，每次使用 M-MLV 1 μl）。
M-MLV 储存液 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 200 mM NaCl 0.1 mM EDTA 1 mபைடு நூலகம் DTT 0.01% NP-40 50% glycerol 5xfirst-strand buffer 成分 250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ℃) 375 mM KCl 15 mM MgCl2 50 mM DTT 保存条件 各组分均-20℃保存，避免反复冻融。
●
在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂以增加 cDNA 合成的长度和产量。RNase 抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲
液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase。蛋白 RNase 抑制剂仅防止 RNase A，B，C 对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的 RNase，因此尽管使用了这些抑 制剂，也要小心不要从手指上引入 RNase。
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------广州东盛生物科技有限公司 电话：020-87791356 传真：020-87791381 网址：
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书说明书一、产品简介takara反转录试剂盒是一种高效、可靠的反转录试剂盒，适用于转录RNA为cDNA的实验操作。
本试剂盒由takara公司制造，经过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。
二、试剂盒组成本试剂盒包含以下组分：1. 反转录酶：高效反转录酶，能在广泛的实验条件下进行反转录反应。
2. 基质：提供反应所需的核酸和其他辅助物质。
3. 标记物：用于标记反转录产物的荧光染料或放射性同位素。
4. 缓冲液：维持试剂盒中酶的活性，调节反应条件的缓冲体系。
5. 控制样品：用于检验试剂盒的反应效果和稳定性。
三、实验操作1. 准备工作在进行实验前，请准备所需的实验仪器和试剂，确保实验环境的清洁和无菌，避免污染对实验结果的影响。
2. RNA提取使用适当的方法提取目标RNA样本，并在提取过程中避免RNA的降解。
3. 反转录反应将提取的RNA样本与反转录试剂盒中的反转录酶、基质和缓冲液按推荐比例混合，并在适当的温度下进行反应。
反应时间根据样本的RNA含量和实验要求确定。
4. 停止反应通过停止反应来终止反转录反应，一般使用热敏感性酶来达到这个目的。
5. 产物处理反转录产物可以直接用于下游实验，如实时定量PCR、聚合酶链式反应等，也可以进行储存和后续处理。
四、实验结果解读根据试剂盒的使用目的和实验设计，对反转录产物进行相应的分析和解读。
常见的分析方法有凝胶电泳、实时定量PCR和测序等。
根据实验结果，可以得到RNA的表达情况、差异表达基因等相关信息。
五、注意事项1. 试剂保存：请按照试剂盒上的说明保存试剂，避免暴露在高温、冻融循环和光照等不利条件下。
2. 操作规范：请按照本说明书中提供的实验操作步骤进行操作，避免实验误差对结果的影响。
3. 质量控制：在每次实验中，请使用合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 废弃物处理：请将使用过的试剂和实验废弃物按照相关规定进行处理，避免对环境造成污染。
M1701 M1705 M-MLV 反转录酶 简明操作说明
产品目录号：M1701 M1705M-MLV 反转录酶简明操作步骤注意：这是节选操作步骤，详细英文说明书见 /tbs/9pim170/9pim170.html 本简明操作步骤电子版见cDNA 第一链合成操作步骤：请使用者准备：z 重组RNasin®核酸酶抑制剂 (目录号N2511) z dATP ,10mM(目录号U1201,100mM) z dCTP ,10mM(目录号U1221,100mM) z dGTP , 10mM(目录号U1211,100mM) z dTTP , 10mM(目录号U1231,100mM) z 无核酸酶的水(目录号P1193)1． 在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：RNA2ug引物 1ug 无核酸酶水补齐至 15ul加热离心管到70℃，5分钟，这样可以打开模板的二级结构。
然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构。
短暂离心，使溶液归于管底。
2. 按以下顺序在复性的引物/模板管(即以上小离心管)中加入下列组分：注意：不要改变引物与mRNA 的比例。
M-MLV 5XReaction Buffer 5ul dATP ,10mM 1.25ul dCTP ,10mM 1.25ul dGTP , 10mM 1.25ul dTTP , 10mM 1.25ul 重组RNasin®核酸酶抑制剂 25units M-MLV 反转录酶 200units 加无核酸酶水补齐至 25ul3. 轻弹离心管混合溶液。
若使用随机引物，在37℃孵育60分钟进行反转录反应；若使用其它引物(Oligo (dT)或基因特异引物)，则在42℃孵育60分钟进行反应。
4. 第二条链合成可使用您选择的操作方法，也可参考: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.注意：M-MLV 反转录酶缓存液与许多下游应用相容。
D2639A[1]反转录试剂盒说明书
![D2639A[1]反转录试剂盒说明书](https://img.taocdn.com/s3/m/9235daa6dd3383c4bb4cd25a.png)
2．PCR 反应 ① 按下列组成配制 PCR 反应液，全量 50 μl。
试剂名称 上述 cDNA 溶液 dNTP Mixture（各 2.5 mM） Forward Primer（10 μΜ） Reverse Primer（10 μΜ） 10×LA PCR Buffer II（Mg2＋ Plus） TaKaRa LA Taq®（5 U/μl） dH2O
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④ 在上述 Microtube 管中配制下列反转录反应液。 试剂名称
上述模板 RNA/引物变性溶液 5×M-MLV Buffer dNTP Mixture（各 10 mM） RNase Inhibitor（40 U/μl） RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/μl） Total Volume
6. 70℃保温 15 分钟后冰上冷却，得到的 cDNA 溶液可直接用于 2nd-Strand cDNA 的合成或者 PCR 扩增等，PCR 扩增时 cDNA 溶液的使用量建议使用 1 μl～5 μl。
●使用λRNA 进行 RT-PCR 反应的实验例
本实验中使用的λRNA 为带有 Poly(A)的λDNA 的转录产物。本实验中分别扩增了 1 kbp、3 kbp、 5 kbp、8 kbp 和 10 kbp 的目的 DNA 片段。
50 % 0.01 %
●起 源： Purified from an E.coli strain expressing a recombinant enzyme.
●活性定义 以Poly（rA）·Oligo（dT）为模板/引物，在 37℃、10 分钟条件下，掺入 1 nmol的 [3H] dTTP所需
要的酶量定义为 1 个活性单位（U）。
使用量 7 μl 2 μl
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整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 7500 Real-Time
PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50×）。
*2：制作标准曲线时梯度稀释 cDNA 或 RNA 标准品的稀释液。模板 DNA 或 RNA 如果用水或 TE
Buffer 稀释时，由于受 Microtube 吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验
结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围
内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和 PCR 反应，用其稀释后的样品可直接使
1×
*
RNase Free dH2O
up to 10 μl
* 反应体系可按需求相应放大，10 μl 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。
2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下: 37℃ 15 min（反转录反应） 85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应） 4℃ 注意：得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过 Real Time PCR 反应体积的 1/10（V/V）量。
-1-
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1． 5×PrimeScript RT Master Mix 在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于 5×PrimeScript RT
Master Mix 粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。 2． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。 3． 本制品中已经加入了反转录 Primer（Oligo dT Primer 和 Random 6 mers），如果要使用 Gene Specific
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● 制品说明
本制品是 2 Step Real Time RT-PCR 用的最佳反转录反应试剂。5×PrimeScript RT Master Mix 中 含有定量 RT-PCR 的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、 Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应 Buffer），加入模板 RNA 和水即可迅速进行反应。使用具有较 强延伸能力的 PrimeScript RTase，与制品 PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Code No.RR037A/B）相同，可以在较短时间内高效合成 Real Time PCR 用模板 cDNA。 本制品合成的 cDNA 可以用于 SYBR® Green 分析法和 TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的与 SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 和 Premix Ex Taq (Probe qPCR)等定量试剂配合使用， 能够进行高性能的基因表达分析。 注意：Takara Bio 使用 SYBR® Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。SYBR® 为 Molecular Probes Inc.的注册商标。
用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。
注意：EASY Dilution 请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用，对于其他公司的同类制品
的适用性本公司尚未进行确认。
● 试剂盒外必备材料
热循环仪（或 37℃水浴和 85℃加热块） 反转录反应所用 0.2 ml 和 1.5 ml 的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌）
● 保 存： -20℃。
●特 长
1． 制品为预先混好的 Premix 形式，只需加入模板 RNA 和水便可以开始反应。 2． 可以在较短时间内高效合成 Real Time PCR 用 cDNA，是进行 2 Step Real Time RT-PCR 反应的
最佳试剂。 3． 使用了 Random 6 mers 和 Oligo dT Primer 2 种反转录引物，可以合成最适的 Real Time PCR 用
cDNA。 4． Real-time RT PCR 定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总 RNA 和反转录 cDNA
稀释到较低的浓度。如果用水或 TE Buffer 稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结 果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液 EASY Dilution（for Real Time PCR），将 Total RNA 或 cDNA 稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
*4 按不同仪器的要求确定反应液的体积。
2. 进行 Real Time PCR 反应 建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。当使用 Tm 值较低的引物或两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。 < Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System , StepOnePlus™>
0.8 μl 0.8 μl 0.4 μl
2 μl
2 μl 2 μl
1 μl 4 μl
0.4 μM*1 0.4 μM*1
1×
dH2O（灭菌蒸馏水） Total
6 μl 20 μl*4
16 μl 50 μl*4
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0 μM 范围内调
使用 StepOnePlus™ Real-Time PCR System 和 7300 Real-Time PCR System 时，请使用
ROX Reference Dye（50×）。
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*3 建议在 20 μl 反应液中使用相当于 10 pg～100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。反转录反应 液的加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。
板。反转录反应液的加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。
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2. 进行 Real Time PCR 反应。 建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序。如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。当使用 Tm 值较低的引物或两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。 两步法 PCR 扩增标准程序：
1. 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂
使用量
终浓度
SYBR® Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)（2×） 12.5 μl
1×
PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） RT 反应液（cDNA 溶液）
Reps：1 95℃ 30 秒 Stage 2：PCR 反应 Reps：40 95℃ 3 秒 60℃ 30 秒 Dissociation Stage
* 使用 StepOnePlus™时请设定在 30 秒。 使用 7300 时请设定在 31 秒。 使用 7500 时请设定在 34 秒。
◆特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司 的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性 化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到 影响。如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。 3. 实验结果分析 反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方 法参见仪器的操作手册。
1.0 μl 1.0 μl 2 μl*2
0.4 μM*1 0.4 μM*1
dH2O（灭菌蒸馏水）
8.5 μl
Total
25 μl
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0
μM 范围内调整引物浓度。
*2 建议在 25 μl 反应液中使用相当于 10 pg～100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模
Primer 进行反转录反应，则不能使用本制品。
● 操作方法
反转录反应 RNA 的制备方法参见“附录”。 1. 按下列组份配制 RT 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂
使用量
终浓度
5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time） Total RNA
2 μl
Stage 1：预变性 Repeat：1
95℃ 30 秒
Stage 2：PCR 反应 Repeat：40 95℃ 5 秒 60℃ 30～60 秒
Stage 3：Dissociation ◆特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的 化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反 应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。
两步法 PCR 扩增标准程序： Stage 1：预变性 Reps：1 95℃ 30 秒