核酸和蛋白质分析技术
蛋白和核酸的分离方法
蛋白和核酸的分离方法1. 引言蛋白质和核酸是生物体内两种重要的生物大分子，它们在细胞的功能调控、遗传信息传递以及疾病发生发展等方面起着关键作用。
对于研究它们的结构、功能和相互作用，需要将其从复杂的细胞或组织中分离出来。
本文将介绍几种常用的蛋白质和核酸的分离方法。
2. 蛋白质分离方法2.1 离心法离心法是一种简单且常用的蛋白质分离方法。
通过利用不同蛋白质在离心过程中的沉降速度差异，可以将它们从混合物中分离出来。
一般情况下，使用超速离心机进行操作。
2.2 凝胶电泳法凝胶电泳法是一种基于蛋白质电荷和大小差异进行分离的方法。
常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
•SDS-PAGE：通过添加表面活性剂SDS使蛋白质带有负电荷，然后根据蛋白质的大小差异进行分离。
•PAGE：不添加SDS，根据蛋白质的电荷和大小差异进行分离。
2.3 柱层析法柱层析法是一种基于蛋白质在柱子中各种填料上的相互作用差异进行分离的方法。
常见的柱层析方法有：•尺寸排除层析：根据蛋白质的大小差异进行分离。
•亲和层析：利用特定配体与目标蛋白之间的特异性结合进行分离。
•离子交换层析：根据蛋白质与填料之间的电荷差异进行分离。
3. 核酸分离方法3.1 酚氯仿法酚氯仿法是一种常用的核酸提取方法，适用于从细胞或组织中提取总核酸。
其原理是利用酚和氯仿形成两相体系，使DNA或RNA从水相转移到有机相中，然后通过离心将核酸从有机相中分离出来。
3.2 硅胶柱层析法硅胶柱层析法是一种常用的核酸纯化方法。
通过将混合样品加入硅胶柱中，利用核酸与硅胶之间的亲和力差异进行分离。
根据不同的条件和方法，可以选择性地分离DNA或RNA。
3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法也可以用于核酸的分离。
与蛋白质的凝胶电泳类似，通过电场作用下核酸在凝胶中的迁移速率差异进行分离。
4. 结论蛋白质和核酸的分离是生物学、生物化学等领域研究的基础工作。
核酸、蛋白检测项目
核酸、蛋白检测项目标题：核酸和蛋白检测项目一、引言在生物医学领域，核酸和蛋白的检测是研究的重要部分。
它们不仅提供了生命现象的基础信息，而且也是诊断和治疗各种疾病的关键工具。
本文将详细介绍核酸和蛋白检测的相关知识及其应用。
二、核酸检测项目核酸（DNA和RNA）是生命体的遗传物质，它们携带了生命体的所有遗传信息。
通过分析核酸序列，我们可以了解生物体的基因型，预测其表型，并且可以用于疾病的诊断和治疗。
1. DNA测序：这是最直接的核酸检测方式，通过对DNA进行测序，可以获取个体的完整遗传信息。
2. PCR技术：PCR是一种用于扩增特定DNA片段的技术，常用于病毒或肿瘤基因的检测。
3. RNA-seq：这是一种高通量的RNA测序技术，可以全面了解细胞中基因表达的情况。
三、蛋白检测项目蛋白质是生命的执行者，它们负责完成所有的生理功能。
通过检测蛋白质的表达和活性，我们可以了解生物体的功能状态，以及疾病的发生和发展过程。
1. Western blot：这是一种常用的蛋白检测技术，可以定量和定性地检测特定蛋白质的存在和表达水平。
2. ELISA：这是一种高度敏感和特异的蛋白检测方法，常用于检测血液中的抗体或抗原。
3. 蛋白质组学：这是一种系统性的蛋白检测方法，可以全面了解细胞中所有蛋白质的状态。
四、结论核酸和蛋白的检测在生物医学研究和临床实践中具有重要价值。
随着科技的进步，我们有越来越多的方法来精确地检测核酸和蛋白，这些技术的发展无疑会推动我们的科研和医疗工作更上一层楼。
五、参考文献[此处列出相关的参考文献]注：以上内容仅供参考，具体操作应根据实际需求和实验室条件进行。
核酸与蛋白质序列分析
光学测序技术利用光信号的变化来检测DNA或RNA序列， 具有高分辨率和高灵敏度等优点，是未来测序技术的重要 发展方向。
人工智能在序列分析中的应用
序列比对
人工智能算法能够快速准确地比对新序列与已知序列之间的相似 性和差异性，有助于发现新的基因和变异。
结构预测
人工智能可以预测蛋白质的三维结构，有助于理解蛋白质的功能和 相互作用机制Maxam-Gilbert和Sanger的DNA测序方法，以及 primer extension method等。这些方法可以提供核酸序列 的精确信息，但通量较低。
下一代测序（NGS）
随着技术的发展，出现了高通量的下一代测序技术，如 Illumina、SOLiD、Ion Torrent和PacBio等。这些技术可以 同时测定大量核酸序列，大大提高了测序速度和通量。
诊断标志物筛选
基于蛋白质序列分析，筛选与疾病相关的生物标志物，用于疾病的早期诊断和预后评估。
04
序列分析的挑战与未来发展
高通量测序技术的局限性
成本高昂
01
尽管高通量测序技术已经显著降低了测序成本，但仍相对昂贵，
限制了其在某些领域的应用。
数据解读难度大
02
高通量测序产生的数据量庞大，需要专业的生物信息学分析方
顺序。
酶降解法
利用特定的酶将蛋白质分解为肽段， 再测定各肽段的氨基酸序列。
自动测序法
利用特定的仪器自动进行蛋白质的 测序，如质谱仪和液相色谱仪等。
蛋白质的变异与修饰
基因突变
由于基因突变导致蛋白质合成过程中出现氨基酸 替换或缺失，从而影响蛋白质的功能。
磷酸化
蛋白质上的特定氨基酸残基被磷酸化，影响蛋白 质的活性、定位和稳定性。
蛋白质含量和核酸含量的测定
• 仪器： 仪器： • 试管及试管架、吸 试管及试管架、 量管、分光光度计、 量管、分光光度计、 分析天平、震荡机、 分析天平、震荡机、 刻度吸管、 刻度吸管、100ml 具塞三角瓶、 具塞三角瓶、漏斗
• 试剂： 试剂： • 双缩脲试剂 • 1. 标准蛋白溶液 • 两种浓度的结晶牛血清 白蛋白溶液(BSA)。 白蛋白溶液(BSA)。 • 2. 待测蛋白质溶液 • 人血清（稀释适当倍数， 人血清（稀释适当倍数， 使其浓度在标准曲线测试 范围内。 范围内。 • 0.05mol/L的NaOH溶液 的 溶液
• 仪器： 仪器： • 凯氏烧瓶500ml、 可 凯氏烧瓶 、 调式电炉、蒸汽蒸馏 调式电炉、 装置、 铰肉机Π 装置、 铰肉机 蓖孔 径不超过4nm、 组 径不超过 、 • 织捣碎机、 粉碎机、 织捣碎机、 粉碎机、 研钵Π 玻璃或瓷质、 研钵 玻璃或瓷质、 化学消化器、 化学消化器、 • 凯氏定氮仪、 空气： 仪器： • 200ug/ml的牛血清白蛋白 的牛血清白蛋白 • v-1100分光光度计、 分光光度计、 分光光度计 溶液、碱性硫酸铜（ 溶液、碱性硫酸铜（当日 恒温水浴箱、试管及 恒温水浴箱、 有效）、 ）、Fu-lin酚试剂 有效）、 酚试剂 试管架、 试管架、加样枪及加 样试架、 样试架、坐标纸
• 仪器： 仪器： • 紫外分光光度计、吸量 紫外分光光度计、 试管和试管架、 管、试管和试管架、移 液枪 • 试剂： 试剂： • 1mg/ml的牛蒡血清白蛋 的牛蒡血清白蛋
• 白溶液、 浓度为 白溶液、 浓度为1mg/ml 左右的蛋白溶液、 左右的蛋白溶液、
四、酚试剂法
• 原理：Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。在 原理：Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。 Folin-酚试剂法中， Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与 酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A 酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物 类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸、 ）。由于蛋白质中酪氨酸 （类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存 该络合物在碱性条件下进而与试剂B 在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨 硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物， 酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色 深浅与蛋白质含量成正比。通过比色测定， 深浅与蛋白质含量成正比。通过比色测定，参照已知含量 的标准蛋白质的标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。 的标准蛋白质的标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。 本法可测定蛋白质含量的范围在25 250μg/mL。 25～ 本法可测定蛋白质含量的范围在25～250μg/mL。由于不 同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同， 同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同，致使等量的 不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致，产生误差。 不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致，产生误差。如果 所用溶液或样品中含有带“ CO-NH2”、 CH2所用溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2” 、 CS-NH2”基团的化合物 基团的化合物， “-CS-NH2”基团的化合物，或者溶液或样品中含有氨基 Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时， 酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时， 会给本方法的测定带来干扰。磷钼酸会给本方法的测定带来干扰。磷钼酸-磷钨酸试剂 Folin-酚试剂B 仅在酸性条件下稳定， （Folin-酚试剂B）仅在酸性条件下稳定，而蛋白质的显 色反应需在pH10的环境中进行，因此当试剂B pH10的环境中进行 色反应需在pH10的环境中进行，因此当试剂B加入后应当 立即充分混匀，以便在磷钼酸立即充分混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前与 蛋白质发生显色反应，这对于结果的重现性非常重要。 蛋白质发生显色反应，这对于结果的
蛋白质核酸沉淀分离技术
优点
操作简便，成本低。
缺点
分辨率较低，只能分离一种核酸。
聚合物沉淀法
原理
利用高分子聚合物将核酸从蛋白质等其他细胞组分中沉淀 出来。
优点
操作简便，对设备要求不高。
步骤
将细胞破碎后的混合物加入离心管，然后加入聚合物溶液 ，进行离心或搅拌，核酸会与聚合物结合形成沉淀，而蛋 白质等其他组分则留在上清液中。
将细胞破碎后的混合物加入离 心管，然后加入氯化铯溶液， 形成密度梯度，进行离心，核 酸会沉降到管底，而蛋白质等 其他组分则浮在上方。
分辨率高，可同时分离多种核 酸。
操作复杂，需要精密的设备。
密度梯度离心法
原理
利用连续的密度梯度将核酸与蛋白质等其他细胞组分分开。
步骤
将细胞破碎后的混合物加入离心管，然后加入密度梯度介质，进行离 心，核酸会沉降到管底，而蛋白质等其他组分则浮在上方。
样品特性
考虑样品的性质和组成，如蛋白质和核酸的分子 量、电荷密度和溶解度等。不同分离方法对不同 特性的蛋白质和核酸的分离效果可能有所不同， 因此需要根据实际情况进行选择。
实验条件
考虑实验室的条件和资源，如设备、空间和预算 等。如果实验室具备离心机和适当的离心管，则 可以选择离心法；如果实验室空间较为紧张，则 可能需要选择操作更为简便的方法。
总结词
其他不常用的蛋白质沉淀分离技术。
详细描述
除了上述三种常用的蛋白质沉淀分离技术外，还有一些不常用的蛋白质沉淀分离技术，如等电点沉淀 法、金属离子沉淀法、免疫沉淀法等。这些方法各有特点，但使用时需根据具体情况选择合适的分离 技术。
03
核酸沉淀分离技术
氯化铯不连续梯度离心法
原理
步骤
蛋白质和核酸相互作用的研究和应用
蛋白质和核酸相互作用的研究和应用蛋白质和核酸是生命体中不可或缺的两种分子。
蛋白质是生命体内众多生物分子中最为普遍的一类，同时也是功能最为多样化的一类生物分子。
核酸则是生命体内遗传物质的主要组成部分。
蛋白质和核酸之间的相互作用一直是生命科学领域中的一大研究热点。
本文将从生物学、化学、生物医学和生物技术等多个角度对蛋白质和核酸之间的相互作用进行探讨。
一、蛋白质和核酸之间的结合生命体内的大部分功能都是由蛋白质和核酸之间的相互作用完成的。
蛋白质和核酸之间的相互作用主要包括直接作用和间接作用两种形式。
直接作用是指蛋白质和核酸之间的物理力相互作用，如静电作用、范德华力、羟基和氨基间的氢键等力。
间接作用则是指蛋白质通过一些其他分子来与核酸进行相互作用，如转录因子、调节蛋白等。
直接作用和间接作用在生命体内的各种生物过程中都起着至关重要的作用。
蛋白质和核酸之间的作用与它们的结构密切相关。
大多数蛋白质和核酸都具有特定的三维结构，这种结构与生命体内各种生物过程的功能密切相关。
蛋白质和核酸的结构与它们之间的相互作用有着密不可分的联系，两者之间的作用会随着结构的改变而发生变化。
二、蛋白质和核酸相互作用的生物学意义蛋白质和核酸之间的相互作用在生物学上具有非常重要的意义。
这种相互作用常常被用来实现生物体内各种生物过程的调节和控制。
例如，许多转录因子是一类可以与DNA结合并实现基因转录调控的蛋白质。
这些蛋白质通过与DNA的结合，可以进而影响DNA上的相应基因的表达，实现对基因转录和表达的调节。
此外，蛋白质和核酸之间的相互作用也是DNA复制、DNA修复、RNA翻译等生物过程的重要组成部分。
三、蛋白质和核酸相互作用的化学基础蛋白质和核酸之间的相互作用在化学上的基础主要是它们在分子水平上的相互作用。
蛋白质和核酸分子之间的相互作用是由不同的化学基团之间的相互作用引起的。
这些化学基团包括胺基、羧基、磷酸基、硫醇基等。
在蛋白质和核酸之间的相互作用中，蛋白质分子通常会与DNA分子之间的磷酸二酯键进行相互作用。
大分子物质分析技术在生命科学中的应用
大分子物质分析技术在生命科学中的应用随着科技的不断发展，大分子物质分析技术正逐渐成为生命科学领域不可或缺的工具之一。
这一类技术以其高效、准确、精细的特点，广泛应用于生物分子的鉴定、定量、分离和纯化，从而为生命科学领域的研究提供了重要的支持和保障。
一、核酸分析大分子物质分析技术在核酸分析中的应用较为广泛，其中最常见的是聚合酶链式反应（PCR）。
通过PCR技术，我们可以在极短的时间内扩增一定数量的DNA序列，从而迅速获取特定DNA序列的信息。
另一个核酸分析的常用工具是凝胶电泳，它可以将DNA片段按照大小分离出来，并通过荧光染料进行检测。
通过这些技术的使用，我们可以获得DNA分析的多项信息，包括碱基序列、长度和纯度等。
二、蛋白质分析大分子物质分析技术在蛋白质分析中的应用也非常广泛，其中较为常见的技术是蛋白质电泳和质谱分析。
蛋白质电泳可以将蛋白质已经其不同的电荷数量和分子质量分离出来，从而提供一些蛋白质的基本信息。
而质谱分析则可以通过检测蛋白质裂解产生的离子，了解多肽序列、氨基酸残基数量和化学修饰等信息。
三、糖分析对于糖类生物分子的分析应用，大分子物质分析技术主要是使用花生四糖凝胶电泳（PAS-PEG）技术。
通过这一技术，我们可以分离出不同长度的糖链，从而了解糖骨架的结构和功能。
四、脂质分析脂质类生物分子非常复杂多样，它们参与了生物体内的许多重要生物过程，然而脂质类物质的分析通常是非常困难的。
大分子物质分析技术在脂质分析领域的应用并不多，主要的如高效液相色谱技术（HPLC），气相色谱技术（GC）和液相色谱技术（LC）。
通过这些技术的使用，我们可以对脂质分子的不同组成进行鉴定，获得其分子结构和动力学特性。
综上所述，大分子物质分析技术在生命科学领域的应用十分广泛。
通过这些技术的高效、准确、精细的特点，我们可以获得多项分析信息，从而深入了解生物分子的结构和功能，为生命科学领域的研究提供了重要的技术支持。
未来，随着分析技术的不断更新升级和技术的不断突破和创新，大分子物质分析技术在生命科学中的应用潜力将会越来越大，为我们揭示生物的奥秘提供更为有效的手段和方法。
核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法
核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法
核酸-蛋白质互作是生物学中一个重要的研究领域，它涉及到核酸和蛋白质之间的相互作用，以及它们在生物体中的功能。
研究这种相互作用的生物化学方法有很多，其中最常用的是蛋白质结构分析、核酸结合实验、蛋白质-核酸相互作用实验和蛋白质-核酸相互作用的分子模拟。
蛋白质结构分析是研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解蛋白质的结构和功能，以及它们与核酸之间的相互作用。
通常，蛋白质结构分析可以通过X射线衍射、核磁共振成像和计算机模拟等技术来实现。
核酸结合实验是另一种研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解核酸与蛋白质之间的相互作用。
通常，核酸结合实验可以通过紫外光谱、荧光光谱和电泳等技术来实现。
蛋白质-核酸相互作用实验是研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解蛋白质与核酸之间的相互作用。
通常，蛋白质-核酸相互作用实验可以通过紫外光谱、荧光光谱、电泳和质谱等技术来实现。
最后，蛋白质-核酸相互作用的分子模拟是研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解蛋白质与核酸之间的相互作用。
通常，蛋白质-核酸相互作用的分子模拟可以通过分子动力学模拟、分子对接和分子模拟等技术来实现。
总之，蛋白质结构分析、核酸结合实验、蛋白质-核酸相互作用实验和蛋白质-核酸相互作用的分子模拟是研究核酸-蛋白质互作的重要生物化学方法。
这些方法可以帮助我们了解核酸和蛋白质之间的相互作用，以及它们在生物体中的功能。
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第一节
核酸分析技术
讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片
一、核 酸 电 泳
Biblioteka （一）DNA的凝胶电泳凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开， 能容纳相对大量的DNA
（5）primer
5’端增加碱基
①内切酶识别点：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG ↑保护bp 对PCR产物cloning有很大好处 便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同 EcoRI 1 BglII 2-3 XbaI 2-3 HindⅢ >3 BamHI 2-3 PstI >4 XhoI >4 NotI >10 如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆 ∵未切开，连接不上
理论 模板扩增30轮 1ng-----------1g 实际 模板扩增30轮 1ng-----------10g
（二）基本要素
1 Taq DNA聚合酶：
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 ①5’3’DNA聚合酶活性； ②无3’5’外切酶活性， 35轮0.25%错配，与原始模板有差别； 最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸 半衰期：92.5℃ 130min 95℃ 40min 97.5℃ 5—6min 变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性
pfu DNA 聚合酶
耐热
5’3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性 精确度：pfu >Taq 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果
¤
2 .引物
人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100l ◆设计原则： （1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同 3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5'————— 3' ——上游Primer ——下游Primer 负链 3'————— 5' 例如： IL-3正链 5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3' 负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5' 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3' 所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'
操作流程
（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）； （2）靶基因样品的制备；
靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5
（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似
封闭 预杂交 杂交 洗脱
（4）杂交信号的检测与结果的分析
（4）Primer 5’未端可修饰、突变:
修饰
如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果
突变：
AGCTCCATGACCCAG 5'CGCTCCATGACCCAG 3'
注意：绝不可以在3'端进行上述改造 ∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸
1. 2. 3. 4.
基因检测： 基因克隆化 DNA突变 DNA序列分析
四、基因芯片
利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究
背景资料
基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃 等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有 可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探 针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加样品 后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ） 就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧 光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的 表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分 析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯 片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。
第二节
蛋白质分析技术
讲述内容：
一、Western Blot 二、ELISA 三、免疫荧光技术 四、免疫组织化学技术 五、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术
一 Western Blot
1
原理：
将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤 维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体 进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标 记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段 时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适 合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异 性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特 异性蛋白的半定量。
注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套
不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：
1 2 3 4 5 DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液
（一）原理：
双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA －－－变性 ↓ 与一对寡核苷酸引物（5’， 3’）降低温度退火 DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火 ↓ 适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA －－延伸
↓
第二轮：变性—退火—延伸
呈指数增长
理论值：一轮一倍
10轮 103=1000倍 20轮 106 30 轮 109
三 PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作 为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的 多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增 产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增 倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学 奖； 目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成
PCR产物的琼脂 糖电泳
聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析
特殊的凝胶电泳
倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分 离分子量10～2000kb的DNA分子；
钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可 分离大于107bp的DNA分子
（二）RNA 电 泳
二 核酸杂交技术
（一）Southern Blot 原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记 物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检 的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有 点突变、扩增重排等。
Plasmid:lng
Chromosome:300-500ng 注意：
防止交叉污染
4.dNTP：
四种脱氧核苷酸，基本原料 终浓度：50M
注意：不稳定，保存时间长会失效
5.Mg2+
TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+
不同的酶需不同Mg2+ Taq：较少，Mg2+ 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度
（1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于Tm值：Tm↑退火T↑； Tm↓退火T↓ 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3）延伸： 500nt---1min 500nt－－3min 一般：40－60sec
（三）PCR技术的应用
激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析
基因芯片的应用
用于基因转录水平的检测、基因组分析 和后基因组研究
举例：美国斯坦福大学Davis等用，然后与热处理的T淋 巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片 段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基 因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证 实，其中3个是未报导的新基因。
（2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少Primer间互补序列
导致2个Primer形成dimer
一般不要超过3个互补bp 如：CCCATGC : : : : GGGTCTA ATGGAGTC : : : : TCAGTAAGC
用于核苷酸多态性的分析
琼脂糖凝胶电泳的基本过程
材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶