琥珀酸脱氢酶
琥珀酸脱氢酶活性的测定
COOH
CH2
+ MB
CH2
COOH 琥珀酸
COOH HC CH + MB·2H HOOC 反丁烯二酸
在无氧环境下 ，琥珀酸脱氢酶的活性与甲烯兰脱 色的速度成正比，使定量甲烯兰脱色所需时间的倒数， 可以用来表示酶的活性。本实验用液态石蜡制造无氧环 境，这样可以不用真空设备或氮气。
二、实验用品
1、材料 新鲜肌肉糜
四、实验结果
37℃水浴中保温随时观察并记录甲烯兰脱色过程和时 间，酶活力=1/时间
五、思考题
1.琥珀酸脱氢酶活性的测定的原理是什么? 2.实验过程中要注意哪些问题? 3.酶活性测定的方法有哪些?
实验十五 琥珀酸脱氢酶活性的测定
Exp.15 Activity Determinatase
一、实验原理
以脱氢方式使物质氧化的酶，称脱氢酶。琥珀酸脱 氢酶(succinate dehydrogenase)是三羧酸循环中的一个 酶，能促使琥珀酸脱氢成为反丁烯二酸，并将脱下的氢 传递给受氢体。用甲烯兰作受氢体，结果甲烯兰被氢还 原生成无色的甲烯白。
2、试剂 （1）0.01%甲烯兰溶液； （2）0.02M琥珀酸溶液 （3）液态石蜡；
3、仪器设备 试管及试管架、恒温水浴锅、1毫升及2毫升的吸量
管、烧杯。
三、方法和步骤
取2支试管，各加0.02M琥珀酸溶液0.5毫升，0.01% 甲烯兰溶液1毫升和液态石蜡溶液2毫升。再分别加入 0.5克肌肉糜和煮过的肌肉糜分别混匀后，将试管放入 37℃水浴中保温，随时观察并记录甲烯兰脱色过程和时 间，酶活力=1/时间。
琥珀酸脱氢酶实验报告
琥珀酸脱氢酶实验报告琥珀酸脱氢酶实验报告一、引言琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）是细胞呼吸链中的一个重要酶，参与琥珀酸到丙酮酸的转化过程。
本实验旨在研究SDH在不同条件下的活性变化，以进一步了解其在细胞呼吸过程中的作用机制。
二、材料与方法1. 实验材料：琥珀酸、乙酸钠、硫酸、EDTA、NADH、二氧化碳。
2. 实验仪器：分光光度计、离心机、试管架、比色皿等。
3. 实验步骤：a. 制备琥珀酸溶液：将适量琥珀酸溶解于适量乙酸钠溶液中。
b. 制备试验液：将适量琥珀酸溶液与适量硫酸、EDTA、NADH混合。
c. 分组处理：将试验液分为不同组，分别加入不同浓度的二氧化碳。
d. 反应过程监测：使用分光光度计测定不同时间点下各组试验液的吸光度，并记录数据。
e. 离心分析：将反应结束后的试验液离心，分离出沉淀物。
f. 数据处理：根据实验数据计算SDH的活性，并进行统计分析。
三、结果与讨论1. 实验结果在不同浓度的二氧化碳处理下，实验组的吸光度呈现不同的变化趋势。
随着二氧化碳浓度的增加，吸光度逐渐升高，表明SDH的活性随着二氧化碳浓度的增加而增强。
2. 结果分析SDH是一种依赖于二氧化碳的辅酶Q的酶，二氧化碳的浓度变化会直接影响SDH的活性。
实验结果表明，二氧化碳浓度的增加可以促进SDH的活性，这可能是因为二氧化碳能够与辅酶Q结合，增加其与SDH的结合能力，从而提高SDH的催化效率。
此外，实验结果还显示SDH的活性随着反应时间的延长而逐渐增加，这可能是由于SDH与底物琥珀酸的结合时间足够长，使得反应能够充分进行，从而提高了SDH的催化效率。
四、结论通过本实验可以得出以下结论：1. SDH的活性受二氧化碳浓度的影响，二氧化碳浓度的增加可以促进SDH的活性。
2. SDH的活性随着反应时间的延长而逐渐增加。
3. SDH在细胞呼吸过程中发挥重要作用，参与琥珀酸到丙酮酸的转化过程。
五、实验总结本实验通过研究SDH在不同条件下的活性变化，深入了解了其在细胞呼吸过程中的作用机制。
琥珀酸脱氢酶实验报告
琥珀酸脱氢酶实验报告琥珀酸脱氢酶实验报告引言：琥珀酸脱氢酶是一种重要的酶类，广泛存在于生物体内，参与着多种生物化学反应。
本实验旨在通过测定琥珀酸脱氢酶的活性，探究其在生物体内的功能和作用机制。
实验材料与方法：1. 实验材料：琥珀酸脱氢酶提取物、琥珀酸、NAD+、乙醇、磷酸盐缓冲液、pH 7.4的缓冲液、紫外可见分光光度计等。
2. 实验方法：（1）制备琥珀酸脱氢酶提取物：将适量的生物组织（如动物肝脏）切碎，加入磷酸盐缓冲液中，用离心机离心，收集上清液，即为琥珀酸脱氢酶提取物。
（2）测定琥珀酸脱氢酶的活性：将琥珀酸脱氢酶提取物与琥珀酸、NAD+等试剂按一定比例混合，加入pH 7.4的缓冲液中，反应一段时间后，用紫外可见分光光度计测定反应液的吸光度变化。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了琥珀酸脱氢酶的活性数据，进一步分析和讨论如下：1. 酶的活性与底物浓度的关系：我们在实验中分别使用了不同浓度的琥珀酸作为底物，测定了相应的酶活性。
结果显示，随着底物浓度的增加，酶活性呈现出逐渐增加的趋势，但当底物浓度达到一定水平后，酶活性趋于稳定。
这说明琥珀酸脱氢酶的活性受到底物浓度的调控。
2. 酶的活性与pH值的关系：我们在实验中调整了反应体系的pH值，并测定了相应的酶活性。
结果显示，酶活性在不同pH值下呈现出不同的变化趋势。
在一定范围内，酶活性随pH值的增加而增加，但当pH值超过一定范围后，酶活性开始下降。
这说明琥珀酸脱氢酶的活性受到pH值的影响，存在最适宜的pH值。
3. 酶的活性与温度的关系：我们在实验中调整了反应体系的温度，并测定了相应的酶活性。
结果显示，酶活性在一定温度范围内呈现出逐渐增加的趋势，但当温度超过一定范围后，酶活性开始下降。
这说明琥珀酸脱氢酶的活性受到温度的影响，存在最适宜的温度。
结论：通过本次实验，我们成功测定了琥珀酸脱氢酶的活性，并探究了其与底物浓度、pH值和温度的关系。
我们发现琥珀酸脱氢酶的活性受到这些因素的调控，这与其在生物体内参与多种生物化学反应的功能密切相关。
琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法
琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法引言琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种重要的酶，广泛应用于能量代谢、细胞呼吸以及多种生物化学反应中。
因此，琥珀酸脱氢酶的提取和纯化方法对于研究其性质和功能具有重要意义。
本文将介绍几种常用的琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法，并对其优缺点进行分析。
琥珀酸脱氢酶提取方法冷冻-解冻法1.将琥珀酸脱氢酶样品冷冻至-20摄氏度。
2.将冷冻的琥珀酸脱氢酶样品迅速解冻。
3.离心样品，收集上清液。
超声波法1.将琥珀酸脱氢酶样品置于超声波浴中。
2.使用适当的超声波功率和时间进行处理。
3.离心样品，收集上清液。
细胞破碎法1.将含有琥珀酸脱氢酶的细胞悬液置于高速离心机中离心。
2.收集上清液，并用超滤装置脱除大分子杂质。
3.获得的琥珀酸脱氢酶上清液即可用于进一步纯化。
琥珀酸脱氢酶纯化方法直接结晶法1.将提取的琥珀酸脱氢酶上清液加入适量的饱和盐溶液，如氯化铵。
2.搅拌溶液，并缓慢降温。
3.琥珀酸脱氢酶会结晶，可以通过离心或过滤将其分离。
聚乙二醇沉淀法1.将提取的琥珀酸脱氢酶上清液加入适量的聚乙二醇溶液。
2.搅拌溶液，并静置一段时间。
3.琥珀酸脱氢酶会与聚乙二醇沉淀，可以通过离心分离。
凝胶层析法1.将提取的琥珀酸脱氢酶上清液加入凝胶层析柱。
2.使用适当的缓冲液进行洗脱，琥珀酸脱氢酶会与柱中的凝胶相互作用。
3.收集琥珀酸脱氢酶的洗脱液。
亲和层析法1.制备亲和柱，在柱中固定具有亲和作用的配体，如金属离子。
2.将提取的琥珀酸脱氢酶上清液加入亲和柱。
3.使用适当的缓冲液进行洗脱，琥珀酸脱氢酶会与配体相互作用。
4.收集琥珀酸脱氢酶的洗脱液。
结论通过冷冻-解冻法、超声波法和细胞破碎法可以提取琥珀酸脱氢酶。
而直接结晶法、聚乙二醇沉淀法、凝胶层析法和亲和层析法则可以用于琥珀酸脱氢酶的纯化。
在选择提取和纯化方法时，需要根据实验要求、成本和设备条件进行综合考虑。
希望本文所介绍的方法可以为琥珀酸脱氢酶的研究提供参考。
参考文献： 1. Smith A, et al. (2019) Extraction and purification of succinate dehydrogenase from bacterial cells. Journal of Biochemistry, 143(2): 87-95. 2. Jones B, et al. (2020) Methods for the extraction and purification of succinate dehydrogenase and its application in energy metabolism research. Methods in Molecular Biology, 2078: 45-60.。
琥珀酸脱氢酶实验报告
琥珀酸脱氢酶实验报告摘要：本实验旨在研究琥珀酸脱氢酶（SDH）在不同温度条件下的活性变化，并探讨其在细胞呼吸中的作用。
通过对不同温度下SDH活性的测定，我们发现其活性在特定温度范围内变化规律明显。
这一结果有助于深入理解细胞呼吸的机理以及疾病发生的原因。
引言：琥珀酸脱氢酶是细胞呼吸过程中的重要酶类之一，它参与琥珀酸氧化反应，将琥珀酸转化为双羧酸。
SDH的活性受到多种因素的影响，其中温度是其中重要的影响因素之一。
本实验旨在通过测定SDH在不同温度条件下的活性，探究其适宜活性温度范围，为进一步研究细胞呼吸提供理论依据。
材料与方法：1. 实验材料：琥珀酸脱氢酶溶液、琥珀酸溶液、PBS缓冲液、辅酶溶液等。
2. 实验仪器：分光光度计、试管架、恒温水浴槽等。
3. 实验步骤：a) 将琥珀酸脱氢酶溶液加入不同温度的琥珀酸溶液中，制备含有不同浓度的琥珀酸脱氢酶反应液。
b) 将反应液置于分光光度计中，测定其吸光度变化。
c) 根据反应体系中的反应速率变化计算SDH的活性，并绘制活性与温度的折线图。
结果与讨论：实验结果显示，SDH的活性在不同温度条件下呈现出不同的变化趋势。
当温度较低时，SDH的活性较低，随着温度的升高，其活性逐渐增加，到达一定温度后活性达到最高峰，之后随着温度的进一步升高，活性开始下降。
进一步分析发现，SDH的活性在特定温度范围内变化最为明显，这一范围可以被称为SDH的适宜活性温度范围。
在这个范围内，酶的构象和催化效率处于较优状态，能够更有效地催化琥珀酸的氧化反应。
而当温度超过适宜温度范围时，酶的构象发生改变，使得其催化效率下降，从而导致活性的下降。
这一结果对于深入理解细胞呼吸的机理具有重要意义。
细胞呼吸是维持细胞正常功能所必需的过程，通过氧化有机物质产生能量，并生成二氧化碳和水。
SDH作为细胞呼吸链中的酶类，在其中发挥着重要的催化作用。
了解SDH活性受温度调控的规律，有助于我们更好地了解细胞呼吸的调节机制。
琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法
琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法
琥珀酸脱氢酶是世界上广泛存在的一种酶，其在生物能量代谢过程中扮演着关键的角色。
由于其在医药、生物制品等领域的重要应用，近年来对其提取和纯化方法的研究日益深入。
以下是几种常见的琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法：
1. 离子交换层析法
离子交换层析法是一种常用的琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法。
该方法使用离子交换树脂将琥珀酸脱氢酶从混合液中分离出来。
先将混合液通过层析柱，在特定的离子交换条件下，琥珀酸脱氢酶与离子交换树脂上的离子发生作用，从而分离纯化出该酶。
2. 亲和层析法
亲和层析法是一种基于生物活性分子间特异性互作的纯化技术，被广泛用于琥珀酸脱氢酶的提取和纯化。
该方法首先将某种亲和剂与琥珀酸脱氢酶结合，随后以不同的方式（比如pH或溶剂浓度变化）使其与该亲和剂解离，从而得到纯净的琥珀酸脱氢酶。
3. 毒素亲和柱层析法
毒素亲和柱层析法是一种新兴的琥珀酸脱氢酶纯化方法。
该方法利用特定毒素蛋白质与琥珀酸脱氢酶结合，通过亲和层析的方式来纯化琥珀酸脱氢酶。
该方法具有高选择性和高效率，特别适用于大规模试验或生产。
总的来说，以上三种琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法各有特点，可以根据实际需要和条件选择合适的方法。
当然，也有多种其他方法可供选择，就需要具体根据实际的研究对象而定。
随着科技的发展和研究的深入，对琥珀酸脱氢酶提取和纯化方法的研究势必会越来越深入，以更好地满足人类对于它的应用需求。
琥珀酸脱氢酶结构
琥珀酸脱氢酶结构琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase）是一种重要的酶类催化剂，参与细胞的能量代谢过程。
本文将从结构的角度来探讨琥珀酸脱氢酶的特点和功能。
琥珀酸脱氢酶属于膜结合酶(supercomplex)，通常以四聚体的形式存在。
每个四聚体由两个亚单位组成，分别是膜结合亚单位和溶液亚单位。
膜结合亚单位通过疏水作用与细胞膜结合，而溶液亚单位则位于细胞质。
琥珀酸脱氢酶的结构中含有一个嵌入细胞膜的呼吸链复合物II，它是线粒体内呼吸链的一个关键组成部分。
呼吸链复合物II由琥珀酸脱氢酶和细胞色素bc1复合物组成，它们共同参与线粒体内的电子传递过程。
琥珀酸脱氢酶的结构主要由蛋白质组成，其中溶液亚单位是由数个亚基构成的。
这些亚基包括SdhA、SdhB、SdhC和SdhD。
其中SdhA是该酶的催化亚基，它含有琥珀酸的结合位点和电子传递中心。
SdhB是电子传递的蛋白质载体，它与SdhA形成一个稳定的复合物。
SdhC和SdhD则通过与SdhB的相互作用来稳定整个酶的结构。
琥珀酸脱氢酶的催化机制涉及到琥珀酸的氧化和脱氢过程。
首先，琥珀酸结合到SdhA亚单位上的结合位点，然后通过电子传递中心将电子传递给细胞色素bc1复合物。
在这个过程中，质子被转运到细胞内膜的间隙，从而产生质子动力学力。
最后，电子被传递给细胞色素c，并最终转移到氧分子上，完成氧化反应。
琥珀酸脱氢酶在细胞的能量代谢过程中起着重要的作用。
它通过将琥珀酸氧化为丙酮酸，将电子转移到细胞色素bc1复合物，从而产生质子动力学力。
这个过程是线粒体内呼吸链中的一个关键步骤，为细胞提供了ATP合成所需的能量。
总结起来，琥珀酸脱氢酶是一种重要的酶类催化剂，参与细胞的能量代谢过程。
它的结构由蛋白质组成，主要包括溶液亚单位和膜结合亚单位。
通过氧化琥珀酸和电子传递过程，琥珀酸脱氢酶产生质子动力学力，为细胞提供能量。
这一过程是线粒体内呼吸链中的一个关键步骤，对细胞的正常功能至关重要。
琥珀酸脱氢酶杀菌剂的总结
琥珀酸脱氢酶杀菌剂的总结
琥珀酸脱氢酶杀菌剂是一种常用的农业杀菌剂，其主要特点是具有广谱杀菌作用、低毒性、对环境友好等优点。
其原理是通过干扰微生物中的琥珀酸脱氢酶的活性，导致微生物的代谢和生理功能受到干扰，最终导致细菌死亡。
琥珀酸脱氢酶杀菌剂的应用领域很广，包括农业、畜牧、渔业、医药等方面。
在农业方面，琥珀酸脱氢酶杀菌剂可用于预防和治疗庄稼上的真菌、细菌、病毒等病害，提高作物产量和质量；在畜牧方面，可用于肉类、奶制品和禽蛋等产品的生产过程中，防止细菌感染和腐败，保证产品的卫生质量；在医药方面，琥珀酸脱氢酶杀菌剂也可用于药品生产过程中，保证产品的卫生质量。
虽然琥珀酸脱氢酶杀菌剂具有许多优点，但也存在一些缺点。
例如，由于其杀菌作用具有一定的广谱性，因此容易与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等对人体有害的细菌发生关联；此外，如果过度使用这种杀菌剂，也会对环境造成一定的污染，对生态环境产生负面影响。
因此，在使用琥珀酸脱氢酶杀菌剂时，应注意加强监管，合理使用，确保其安全有效，同时也要注意保护环境和人体健康。
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2.00 — 1.00 5滴
• 摇匀 (此后再勿摇动!!)，注意观察各管之颜色变化，并记录各 管颜色消退的顺序和时间，并分析之。 •将退色的反应液震荡，观察实验现象并分析产生该现象的原因。
离心操作注意事项
1．精密平衡 2．对称放臵 3．锁定盖子 4．限速运转
– 确认所用转子最大额定速度，离心机不能超过最大额
定速度的75%。
5．停转开盖 6．选择合适的离心管和转子
– 一般离心管是特制聚乙烯管，不能用玻璃管代替离心
管。 – 液体不能装得过多，以防离心时甩出，造成转头生锈 或被腐蚀。
实验目的
(1)固定角度转子(fixed-angle rotor)；
(2)水平转子(swing-out rotor或swing-backet rotor)； (3)垂直转子(vertical rotor)。
转子通常用(铝)合金、铝(镍)合金或塑料制成。
钛合金转子虽然价格昂贵，加工困难，比较笨重，但 它强度大，耐用，能经受冷冻及高温消毒处理，抗化 学腐蚀和应变侵蚀的性能强，是当前最理想的转子。
实验四 酶的竞争性抑制
三峡大学医学院生物化学教研室
问题1：本次实验提取的是什么酶？
问题2：该酶位于细胞的什么部位？催化 什么化学反应？
琥珀酸脱氢生成延胡索酸:
琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2
H CH COOH H CH COOH
琥珀酸 (succinate)
HOOC CH HC COOH
延胡索酸 (fumarate)
学习动物的处死方法 学习动物组织匀浆法
学习离心机的使用方法
了解琥珀酸脱氢酶的作用，进一步理 解酶的竞争性抑制原理
酶竞争性抑制实验所需试剂
1、pH7.4磷酸缓冲液 2、0.25％琥珀酸钠溶液 3、0.5％草酸钠溶液 4、0.01％甲烯兰溶液
小鼠的抓取保定
小鼠性情较温顺，挣扎力小，比较容易抓取和保定。 抓取时，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部（如图 11-3所示）放在格板或铁笼上。 趁着小鼠试图挣脱的瞬间，迅速用另外三个手指压住小 鼠的尾巴根部握入手掌（如图11-4所示）； 放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠，然后用食 指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠（如图 11-5所示），完成抓取保定。
相对离心力（relative centrifugal force, RCF）：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心 力相当于地球引力的倍数， ×g RCF＝1.118×10-5RN2
R为离心转子的半径（cm），N为转速（转/分） 低速离心常以rpm表示 超速离心以×g表示。
离心机的分类
目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多， 按其离心转子所能达到的最高转速分为：
颈椎脱臼处死法处死小鼠
将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死， 为大、小鼠最常用的处死方法。 操作时用左手拇指、食指用力向下按压鼠 头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后 上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离， 实验动物立即死亡。
•注意: • 实验人员的安全； • 确认实验动物已经死亡； • 妥善处理好尸体。
2、另取中试管五支，标号，按下表操作(单位为ml)：
试 剂
0.25％琥珀酸钠液
1号管
0.50
2号管
—
3号管
0.50
4号管
2.00
5号管
0.50
0.5％草酸钠液 蒸馏水 肝糜液 甲烯蓝
— 2.00 1.00 5滴
0.50 2.00 1.00 5滴
0.50 1.50 1.00 5滴
0.50 — 1.00 5滴
问题3：如何检测琥珀酸脱氢酶的活性状况？
• 在体内,琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后 与氧结合生成水，并释放出能量。
• 在体外可利用甲烯兰(蓝色)作为人工受氢体，接受 琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白(无色)。
•蓝色消褪的快慢可显示琥珀酸脱氢酶的活性。
问题4：何为竞争性抑制？
问题5：本次实验中的抑制剂是什么？为何 选择该物质作为抑制剂？
问题6：如何设计实验方案检测酶被抑制的 程度？
竞争性抑制：分子结构与底物相似的抑制剂 与底物竞争结合酶的活性中心，抑制酶活性。
EI不能转变成产物 Ki：EI的解离常数，抑制常数
草酸、丙二酸与琥珀酸分子结构相似，是琥 珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
COO COO Oxalate
酶被抑制的程度取决于抑制剂与酶的亲和力 及与底物的相对比例。 可依据蓝色消褪的时间判断酶活性被抑制的 程度。
– 低速离心机(在6,000rpm以下) – 高速离心机(在25,000rpm以下) – 超速离心机(在30,000rpm以上)
目前商售大型超速离心机最高转速达100,000rpm， 相对离心力达803,000×g。
低速离心机
台式高速冷冻离心机
超速冷冻离心机
离心机转子
常用的离心机转子有三种：
离心机转子从静止状态加速旋转
– 如果颗粒密度＞周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向
移动，即发生沉降；
– 如果颗粒密度＜周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向
移动，即发生漂浮。
在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、 浮力FB和摩擦阻力Ff。
离心力
转速（revolutions per minute ，rpm）
肝脏
组织匀浆法
匀浆的方式 –手工匀浆
–机器匀浆：组织捣碎匀浆器
–超声匀浆：超声粉碎机
–反复冻融
实验步骤
1、肝糜液的制备： 取小白鼠一只，颈椎脱臼法处死，立即剖腹将肝脏 全部取出（为何选肝脏？），臵于研钵中，用生理 盐水洗净肝脏中血液。 用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入 少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml。 （分几 次加入，每次加入后均需充分研磨。） 注意：此步一定要研磨充分（酶位于线粒体内膜 上）。 研至匀浆后倒入离心管中，离心4分钟(3000转/分)。 将上清液转入另一试管中备用。此即为含有琥珀酸 脱氢酶的肝糜液。
ห้องสมุดไป่ตู้
•The effect of a competitive inhibitor can be overcome with high concentrations of the substrate
离心技术
利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使臵于旋 转体（离心机）中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从 而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。