克伦特罗(Clenbuterol)ELISA检测试剂盒说明书
克伦特罗说明书一步法
盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒使用说明书一、概要克伦特罗（clenbμterol，CLE）是一种 －肾上腺受体激动剂，此类药品在临床上用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病。
因为该药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。
人食用了饲喂克伦特罗作为添加剂的动物所产生的畜产品后，残留的克伦特罗可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康造成极大危害。
我国农业部第235号文件规定不得检出。
本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出尿样、肌肉、肝脏及饲料等中的克伦特罗。
二、测定原理本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被抗克伦特罗抗体。
检测时，加入标准品或样品溶液及克伦特罗酶结合物，他们竞争性地与克伦特罗抗体结合，形成抗原抗体复合物；用TMB底物显色；加入反应终止液后在450nm波长酶标仪下进行检测，样品中的克伦特罗浓度与吸收光强度成反比。
三、试剂盒组成酶标板1块(包被抗克伦特罗抗体)标准液6瓶（1ml/瓶）：0、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb。
酶结合物…………………………7ml显色剂A …………………………7ml显色剂B …………………………7ml终止液…………………………7ml10×浓缩洗涤液…………………50ml说明书……………………………1份四、需要但试剂盒中不提供的器材和试剂（1）设备……微孔板酶标仪(450nm)……振荡器……离心机……微量移液器：20μl～200μl,100μl~1000μl……容量瓶：100ml，500ml，1000ml（2）试剂……三氯乙酸……氢氧化钠……叔丁基甲醚色谱级……浓HCl……氯仿……磷酸……Tris……乙酸乙酯……乙腈五、样本前处理步骤样本处理前须知处理任何样本时，都须注意：（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
意大利盐酸克伦特罗ELISA试剂盒
盐酸克伦特罗ELISA试剂盒1．简要信息此试剂盒可以定量检测血清，尿，牛奶，奶粉，肝，饲料，眼等样品中的盐酸克伦特罗浓度。
可做96个检测2．介绍β-agonists药物是用来治疗人体和兽医的喘息病，过量的摄入 β-agonists将会使脂肪转化为肌肉组织。
在欧盟，家畜养殖过程中使用这种药物是非法的。
近年来使用盐酸克伦特罗或者其他B-动物兴奋剂导致的中毒事件也有不断的报道。
检测生物样品中的盐酸克伦特罗可以使用酶联免疫方法的筛选可以在短时间内检测大批量的样品。
尿样不需要前处理可以直接使用，而饲料和其他生物样品只需要简单的前处理。
3．使用方向此试剂盒是利用竞争酶联免疫方法检测 β-agonists药物残留，适合于检测人体，牛和猪的尿样，血清，以及眼，肝，饲料，牛奶和奶粉。
不需要样品纯化，对于尿和血清样品不需要前处理直接使用，对于其他生物样品的前处理也是非常快速的。
4．检测原理此试剂盒是在包被有山羊抗兔IgG的塑料微孔板上操作，克伦特罗标准品，样品，酶联结合物以及兔抗 β-agonists抗体加入到微孔中。
在培养期间，游离的 β-agonists和标记有酶的 β-agonists竞争于抗 β-agonists抗体结合，抗克伦特罗抗体和固定在微孔壁上的山羊抗兔IgG结合。
任何没有结合的酶联结合物在冲洗阶段，酶的活性是由加入的显色酶底物的量决定。
酶把无色的染色剂转变成蓝色，加入终止液后是微孔从蓝色变成黄色，然后通过450nm酶标仪读数，颜色的密度和样品中 β-agonists的浓度成反比。
5．提供的试剂●微孔板（12×8）：包被有山羊抗兔IgG●标准液：7瓶不同浓度的克伦特罗标准溶液（1ml容量），分别是0ppb, 0.15ppb, 0.3ppb, 0.6ppb, 1.25ppb,2.5ppb, 5ppb，白色盖子的玻璃瓶。
●抗 β-agonists抗体：12ml的蓝色盖玻璃瓶●酶联结合物：12ml的红色安培瓶●10倍浓缩的冲洗液：50mL的塑料瓶●底物溶液：24mL的塑料安培瓶●终止液：1瓶白色盖子的9ml溶液6．实验需要但是没有提供的材料样品准备过程：-盐酸-氢氧化钠-枯草杆菌蛋白酶-磷酸缓冲液-Ultra-turrax-平板离心机-研磨-天平-PH计检测过程：-20-200ul的可调精确微量加样枪以及加样头-50-200ul的可调多道微量加样枪以及加样头-450nm的酶标仪7．使用者需要的警告和注意点- 只能做提外检测- 试剂包含防腐剂，终止液包含硫酸具有腐蚀性。
克伦特罗说明书
克伦特罗酶联免疫检测试剂盒(产品编号：CB1418)使用说明书一、试剂盒简介本试剂盒适用于组织、饲料及尿样内所含克伦特罗的定量测试。
试剂盒性能稳定，操作便捷，灵敏度高。
试剂盒包括以下内容：注：所有浓缩液均需稀释后使用，稀释方法见试剂制备及使用检测下限二、CB1418 克伦特罗试剂盒检测原理1、在可拆解成条状的酶标板上，已包被了克伦特罗特异性抗体。
2、标准液或样品中的克伦特罗会和酶标记物争夺酶标板上抗体的结合位点，形成抗体/抗原复合物或抗体/酶标抗原复合物。
3、洗涤酶标板，除去游离的酶标记物。
加上底物/发色剂。
在一定的温度范围内，抗体/酶标抗原复合物催化底物/发色剂发生显色（蓝色）反应。
加入酸后，反应终止，同时反应物的颜色由蓝色转为黄色。
4、颜色的深度与克伦特罗含量成反比。
在450纳米（nm）波长的酶标仪上，可读出相应的吸光度值。
三、样品制备（一）尿液样品制备尿样不用处理，清亮尿样直接测定（如果尿样有比较严重的浑浊，要过滤或离心直至得到清亮尿样）（二）组织样品制备（肝、肾、肌肉、视网膜）所需要的试剂：50mmol/L 盐酸：一般购买的浓盐酸为10mol/L，所以用蒸馏水按体积比1（浓盐酸）：199（蒸馏水）进行稀释即可500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：例如用6.8g磷酸二氢钾固体溶于100mL蒸馏水中，再用强酸调pH值到3.050mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：用500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液稀释十倍，再检查pH值是否为3.01 mol/L氢氧化钠：例如用4.0g氢氧化钠固体溶于100mL蒸馏水甲醇(100%)：一般市场上购买的产品达到分析纯即可所需要的仪器：冷冻离心机：要有50mL的离心管和相应的转子均质器：要求转数在4000转以上样品前处理步骤：1.5g 粉碎的样品与25mL 50mmol/L HCL混合，振荡1.5小时，以达到均质的目的。
2.称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中3.离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15 OC（50-59℉）4.转移上清液到另一个离心瓶中，加300uL 1 mol/L氢氧化钠混合15分钟.5.加入4mL 500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0，简单的混合并在4O℃保存至少1. 5小时或过夜6.离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15 OC（50-59℉），分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（20-25℃），然后用以下方法进行C-18柱纯化C-18 柱纯化方法：（1）用3mL甲醇（100%）洗涤柱子，流速为1滴/每秒（2）用2mL 50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/每秒（3）样品进柱（肝，肉，或组织的全部上清液），流速为1滴/4每秒（4）用2mL 50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/每秒（5）用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2分钟干燥柱子（6）用1mL甲醇（100%）洗脱样品，流速为1滴/4每秒（7）在50-60℃并且在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇（8）用1mL蒸馏水溶解干燥的残留物进行分析注意:A.所有试剂和样品处理必须在室温条件下（20-25℃）并严格控制过柱时的流速B.在第（7）步中如果很难蒸发干甲醇，说明含有一定的水分，原因主要出在第（5）步中没有吹干柱子或甲醇本身有质量问题C.最后处理完的样品可能有黄色，属于正常现象，不影响以后的实验D.未处理的样品冷冻保存E.HCL均质后的样品在2-8℃稳定3天F.以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（C18 柱纯化之前）在2-8℃稳定2天,使用前离心G.C-18 柱纯化步骤6所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存数周, 在2-8℃稳定2周视网膜样品应该采用以下方法快速抽提：1)称取0.1g视网膜，加入贴有标签的聚苯乙烯容器中或玻璃试管中。
盐酸克伦特罗快速检测试剂盒概要
盐酸克伦特罗快速检测试剂盒产地：比利时Bio-X1.检测原理 8. 工作液的准备2.操作时间 9. 样品前处理3.检测下限 10. 酶联免疫实验设计4.回收率 11. 操作步骤5.交叉反应率 12. 结果计算6.试剂盒的组成 13. 结果分析7.需要设备及试剂 14.注意事项简介：克伦特罗（Clenbuterol）属于beta兴奋剂，是一种高选择性的兴奋剂和激素，具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用。
进年来被一些人非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物的生长。
当用作生长调节剂时，其添加量是治疗量的5—10倍，常在动物体内残留而给消费者带来危害。
通常，HPLC或GC-MS是克伦特罗残留检测的确证方法，但是其前处理步骤费用昂贵，而ELISA快速检测试剂盒因成本低、操作简便、速度快、一次检测样本量大、仪器化低，现已成为常规的筛选方法。
1.检测原理：测定的基础是抗原抗体反应。
微孔板上包被有抗兔IgG（Clenbuterol抗体）的羊抗体，含有克伦特罗抗原的样品或标准品与酶标记物被加入到小孔中，经过孵育及洗涤步骤后，游离的抗原与抗原酶标记物竞争抗体结合位点，没有结合的抗原酶标记物在清洗步骤中被除去，将显色液加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。
加入反应终止液后使颜色由蓝色转为黄色。
在450nm处测量，吸光强度与样品的克伦特罗浓度成反比。
2.操作时间： 1小时(30分钟孵育+30分钟显色)3.检测下限：0.1ppb4.回收率：尿样和血清： 97-110%饲料： 95-100%肝脏/组织： 90-97%牛奶及奶粉 100%5.交叉反应率：Clenbuterol (克伦特罗) 100%Mabuterol（马普特罗） 100%Mapenterol（马喷特罗） 100%Salbutamal (沙丁胺醇) 8-9%Terbutalin (特普他林) 7-8%Simarterol(塞曼特罗) <0.1%Isoproterenol（异丙肾上腺素） <0.1%Fenoterol（非诺特罗） <0.1%6.试剂盒的组成：1)96孔酶标板：12条╳8孔（包被有羊抗兔IgG）.2)克伦特罗标准液6瓶：1ml /瓶，为Clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml3)酶联结合物Conjugate peroxidase： 6ml 黄盖4)抗Clenbuterol抗体溶液：Anti-clenbuterol antibody 11ml 红盖7)显色溶液Chromogen： 3 ml 黑盖8)样品稀释液（需20倍稀释）Diluent solution: 10ml 绿盖9)反应终止液Stop solution： 6ml 白盖7.需要设备及试剂（试剂盒中未提供）设备：1）均质器2）振荡器3）微孔酶标仪（450nm）4）离心机5）20ul，50ul，100ul，200ul微量加样器试剂：1）氢氧化钠2）0.01M HCL3）5M盐酸4）蒸馏水8.工作液的准备：1）洗液：用蒸馏水按（1+9）稀释2）样品稀释液：将样品稀释液用蒸馏水按（1+19）稀释（注：在使用前再配）。
实验一 克伦特罗直接竞争ELISA检测实验指导
实验一克伦特罗(瘦肉精)直接竞争ELISA检测克伦特罗（clenbuterol），化学名为4-氨基-α-[ (叔丁胺基)甲基]-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐，属于β-兴奋剂（β-Agonist）的一种。
由于克伦特罗能显著降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉产量（由此得名“瘦肉精”），曾在畜牧业上作为生长促进剂被广泛使用。
克伦特罗有较大的毒性，当人们食用高残留克伦特罗的动物性食品时，会出现心悸、头疼、目眩、恶心、呕吐、发烧、颤栗、神经过敏、血管扩张、心率加快、肌肉震颤等中毒症状。
因此，欧美等国早已禁止克伦特罗在畜牧生产上的应用，我国农业部于1997年3月发布[农牧发(1997)]3号文件，禁止克伦特罗在动物生产中的应用。
1999年再次发布文件，禁止其使用，并规定了在动物组织中的最高限量。
然而，由于经济利益的驱使，克伦特罗违法滥用的现象仍然较为普遍，中毒现象屡屡发生。
图1 克伦特罗分子结构式检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法（HPLC），气相色谱－质谱法（GC-MS），毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）等等。
HPLC法与GC-MS 法是克伦特罗残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，而酶联免疫分析（ELISA）快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法。
1 实验原理在微孔条上预包被偶联抗原；加入样品或标准品，样品或标准品中的克伦特罗与微孔条上预包被的偶联抗原竞争结合酶标记的克伦特罗单克隆抗体，游离的酶标记抗体通过洗涤被除去；再加入显色液，结合的酶标记抗体使无色的显色液转化为蓝色，加入反应终止液后再转变为黄色，在450nm处测量，样品吸光值与样品中克伦特罗含量成负相关，通过标准曲线即可计算出样品中克伦特罗含量。
检测原理示意图如下所示：①未包被酶标板②将包被抗原包被在酶标板上③首先将标准品或待检样品加入到包被好的酶标板微空内④然后加入辣根过氧化物酶标记的抗体，孵育期间包被抗原与样品中的被检药物将同时竞争酶标抗体，如果样品中的被检药物含量多则与包被抗原结合的酶标抗体就少，反之就多⑤通过洗涤将反应液中未与包被抗原结合的酶标抗体去除⑥加入底物缓冲液与底物液的混合液，酶标抗体上辣根过氧化物酶将催化底物进行显色反应（由无色变为蓝色）⑦达到显色时间后，加入硫酸溶液终止酶促反应，同时反应溶液由蓝色变为金黄色，此反应液可通过酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，从而通过软件计算得到待检药物的浓度2 实验材料（1）克伦特罗ELISA试剂盒：百睿或其他同类产品。
克伦特罗检测试剂盒使用说明书 Kit CatalogNo BC-3003
克伦特罗检测试剂盒使用说明书Kit Catalog No.BC-3003一、概要:克伦特罗(Clenbuterol)，俗称瘦肉精，是一种β2兴奋剂。
能提高动物体内的瘦肉的比例，并加速动物生长，而被广泛添加于动物饲料中，然而其会残留在动物体内，人类食用后会产生严重的副作用，轻则导致心跳及心率不正常，重则可引发心脏病。
目前，许多国家政府已明令禁止其使用于动物饲料中。
本公司研发生产的克伦特罗检测试剂盒的检测结果准确、稳定，可检测存在于动物的尿液、血清、血浆、组织(肌肉、心脏、肝脏等)、及动物饲料樣本中的克伦特罗。
样品前处理方式简单、方便，适用于各级政府食品安全检测机构、各类屠宰企业、肉类食品加工及饲料生产企业等。
二、检测原理:本试剂盒利用竞争酶联免疫方法，预先在微孔中包被羊抗兔抗体，实验时先后加入克伦特罗标准品，或待测样本，克伦特罗酶标抗原和兔抗克伦特罗抗体。
经过室温温育，反应液中的兔抗克伦特罗抗体与微孔板上的羊抗兔抗体结合，待测样品中的克伦特罗与克伦特罗酶标抗原竞争微孔板上的兔抗克伦特罗抗体。
洗涤后，没有与抗体结合的待测样品中的克伦特罗或酶标抗原被洗去，再加入反应底物，结合的酶标抗原的酶将底物转化为蓝色产物，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色。
反应完成后，样品中克伦特罗含量越多，反应呈色就越浅；反之，样品中克伦特罗含量越少，则呈色越深。
利用标准曲线可计算出样品中克伦特罗含量。
三、试剂盒提供试剂:1.羊抗兔抗体包被的微孔板:96孔。
2.克伦特罗参考标准品:0，0.05，0.25，1.00，2.50，5.00ppb (ng/ml);1.5ml/瓶，一套共6瓶。
3.克伦特罗酶标抗原试剂(1X):7ml/瓶。
4.兔抗克伦特罗抗体:7ml/瓶。
5.样品稀释液：100ml/瓶。
6.显色剂/底物：11ml/瓶。
7.反应终止液：11ml/瓶。
8.洗涤液(20X)：50ml/瓶，使用前稀释20倍。
四、其它试剂和仪器:1.试剂∙盐酸(5mM,10mM )∙氢氧化钠溶液(2.0M )2.仪器∙均质机(Ultra-turrax)∙微孔板酶标仪∙振荡器∙离心机∙氮气吹干仪或旋转蒸发器∙超声波破碎仪∙20µl,50µl,100µl,200µl,及1ml 移液器五、待测样品处理方法:1.尿液将样品在室温(18-25ºC)以4,000转离心10分钟后取上清液或者过滤后取滤液100克伦特罗检测试剂盒使用说明书Kit Catalog No.BC-3003μl,加入样品稀释液400μl （5倍稀释），用于下一步检测。
克伦特罗酶免疫定量检测试剂盒 说明书
ELISA kit for quantitative detection of Clenbuterol概述：克伦特罗(Clenbuterol)属于一类β-兴奋剂，具有改进脂肪型动物体内肉与脂肪的比例的作用，亦可促进动物生长。
但同时，此药物还会使非横纹肌松弛，人体摄入后可引起心跳、心率不正常等副反应，甚至可导致心脏病。
因此在我国，克伦特罗在畜牧业上的使用是被严格禁止的。
本试剂盒利用竞争酶联免疫法对生物样品中的克伦特罗进行定量分析。
适用于动物尿液、血清、内脏等物质中克伦特罗的快速检测。
由于ELISA法的高通量与简便快速，适合大量样本的定量筛查，自样本加入至结果读出，不超过60分钟，检测灵敏度为0.1ppb。
一、简要原理试剂盒所提供的微孔板上包被有抗体，然后将校准品或样本中的克伦特罗与酶标记的克伦特罗加入微孔中后，两者可竞争结合克伦特罗抗体，洗去未结合的酶标记克伦特罗。
加入底物后，在酶作用下，底物溶液会显蓝色，加入终止剂后，溶液由蓝转为金黄色。
在450nm波长光下测吸光度，吸光度高低与校准品或样品中克伦特罗的含量呈反比，根据校准品的读数作出校准曲线，并利用校准曲线计算出样品中克伦特罗的含量。
二、试剂盒组成1.酶标96孔易折板(抗体已包被)……………………………………………………………………… 96孔2.克伦特罗校准品(0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb)…………………………… 1 套3.11×浓缩酶标记物…………………………………………………………………………1瓶4.底物溶液…………………………………………………………………………1瓶5.酶标稀释液………………………………………………………………………1瓶6.50×浓缩洗涤液……………………………………………………………………1瓶7.终止剂……………………………………………………………………………1瓶8.其他（说明书、自封袋、封板膜）…………………………………………………………………1套2-8℃贮存，有效期一年三、实验需要但试剂盒不提供的试剂和仪器1.试剂…………50mM盐酸溶液…………氯化钠…………50mM PH7.0 PBS (配制:9g NaCl；4.65g Na2HPO4·12H2O；0.56g NaH2PO4·2H2O 溶解于1000ml 蒸馏水中)…………2M 氢氧化钠溶液…………异丙醇和乙酸乙酯2.仪器…………微孔板酶标仪…………涡旋振荡器或超声波粉碎仪或摇床…………离心机及离心管…………20μl、200μl、1ml移液器…………氮吹仪或旋转蒸发仪ELISA kit for quantitative detection of Clenbuterol四、待测样品处理方法1.尿液新鲜尿液可直接测定，如尿液混浊，则离心取上清进行检测。
克伦特罗(Clenbuterol)ELISA检测试剂盒说明书
克伦特罗(Clenbuterol)ELISA检测试剂盒说明书一、概要克伦特罗（Clenbuterol）属于β-兴奋剂，因为该药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。
人食用了饲喂克伦特罗作为添加剂的动物所产生的畜产品后，残留的克伦特罗可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康造成极大危害。
因此世界许多国家现已被明令禁止在饲料中添加克伦特罗来增加动物的瘦肉率。
HPLC或GC-MS一直用作检测β兴奋剂的方法，但是其前处理步骤费用昂贵；而使用酶联免疫检测试剂盒方法则可以经济、快速地检测尿，肌肉，肝脏及饲料中的CLE。
本试剂盒是应用ELISA技术研发而成的检测产品，操作时间短于45min，能最大限度地减少操作误差和工作强度。
二、试验原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被克伦特罗抗原，样本残留的克伦特罗和微孔条上预包被的抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物克伦特罗负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中克伦特罗的含量。
三、适用范围可定性、定量检测动物组织、饲料、尿液等样本中克伦特罗的残留量。
四、交叉反应率克伦特罗………………………………………………100%特普他林……………………………………………小于1%非诺特罗……………………………………………小于1%马布特罗……………………………………………小于1% 西马特罗…………………………………………小于1%溴布特罗……………………………………………小于1% 塞曼特罗……………………………………………小于1% 五、使用单位需自备的设备及试剂设备：┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm┅┅振荡器┅┅涡旋仪┅┅离心机┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、50ml┅┅微量移液器：单道20μl～200μl、200μl～1000μl多道250μl试剂：┅┅甲醇(分析纯) ┅┅氢氧化钠(分析纯)┅┅浓盐酸----去离子水六、提供的材料与试剂1、96孔酶标板×1块2、标准品×6瓶：(1ml/瓶）0ppb, 0.05ppb, 0.15ppb,0.45ppb, 1.35ppb,4.05ppb3、高浓度标准品：100ppb （1ml/瓶）4、克伦特罗酶标物…………………………………………7ml5、克伦特罗抗试剂…………………………………………9ml6、底物液A液………………………………………7ml7、底物液B液………………………………………7ml8、终止液…………………………………………7ml9、浓缩洗涤液(10×) ……………………………………40ml10、克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)…………………………40ml七、溶液的配制配液1: 样品稀释液用去离子水将克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)按1:1体积比进行稀释，即：1份克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)+1份去离子水；用于提取样本的稀释，样品稀释液在4℃环境可保存一个月。
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克伦特罗(Clenbuterol)ELISA检测试剂盒说明书一、概要克伦特罗（Clenbuterol）属于β-兴奋剂，因为该药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。
人食用了饲喂克伦特罗作为添加剂的动物所产生的畜产品后，残留的克伦特罗可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康造成极大危害。
因此世界许多国家现已被明令禁止在饲料中添加克伦特罗来增加动物的瘦肉率。
HPLC或GC-MS一直用作检测β兴奋剂的方法，但是其前处理步骤费用昂贵；而使用酶联免疫检测试剂盒方法则可以经济、快速地检测尿，肌肉，肝脏及饲料中的CLE。
本试剂盒是应用ELISA技术研发而成的检测产品，操作时间短于45min，能最大限度地减少操作误差和工作强度。
二、试验原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被克伦特罗抗原，样本残留的克伦特罗和微孔条上预包被的抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物克伦特罗负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中克伦特罗的含量。
三、适用范围可定性、定量检测动物组织、饲料、尿液等样本中克伦特罗的残留量。
四、交叉反应率克伦特罗………………………………………………100%特普他林……………………………………………小于1%非诺特罗……………………………………………小于1%马布特罗……………………………………………小于1% 西马特罗…………………………………………小于1%溴布特罗……………………………………………小于1% 塞曼特罗……………………………………………小于1% 五、使用单位需自备的设备及试剂设备：┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm┅┅振荡器┅┅涡旋仪┅┅离心机┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、50ml┅┅微量移液器：单道20μl～200μl、200μl～1000μl多道250μl试剂：┅┅甲醇(分析纯) ┅┅氢氧化钠(分析纯)┅┅浓盐酸----去离子水六、提供的材料与试剂1、96孔酶标板×1块2、标准品×6瓶：(1ml/瓶）0ppb, 0.05ppb, 0.15ppb,0.45ppb, 1.35ppb,4.05ppb3、高浓度标准品：100ppb （1ml/瓶）4、克伦特罗酶标物…………………………………………7ml5、克伦特罗抗试剂…………………………………………9ml6、底物液A液………………………………………7ml7、底物液B液………………………………………7ml8、终止液…………………………………………7ml9、浓缩洗涤液(10×) ……………………………………40ml10、克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)…………………………40ml七、溶液的配制配液1: 样品稀释液用去离子水将克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)按1:1体积比进行稀释，即：1份克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)+1份去离子水；用于提取样本的稀释，样品稀释液在4℃环境可保存一个月。
配液2: 洗涤工作液用去离子水将浓缩洗涤液(10×)按1:9体积比进行稀释，即：1份浓缩洗涤液(10×)+9份去离子水；用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
配液3: 1M 氢氧化钠溶液称取 4.0g 氢氧化钠加去离子水混匀溶解定容至100ml。
配液4: 0.1M 盐酸溶液量取0.83ml浓盐酸加去离子水混匀定容至100ml配液5：25%甲醇溶液将25ml无水甲醇加入到75ml去离子水中并充分混匀配液6：组织样本提取液80ml 25%甲醇溶液加20ml 0.1M 盐酸八、样本前处理步骤样本处理前须知：（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
（c）未处理的样本需冷冻保存。
（d）处理后的样本可在2-8℃避光保存24h。
（一）组织（带有低脂肪的肉、肝）----称取2.0±0.05g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；----加入6ml组织样本提取液，用振荡器振荡摇；---- 4000r/min离心10min；----取1ml上清液,加入20μl 1M 氢氧化钠溶液混匀（混匀后测定pH值，大约为8）；---- 4000r/min离心5min；----取上清液20μl用于分析。
（二）尿液----取20μl清亮尿样直接测定（如尿样浑浊须经过滤或3000g 以上，15℃离心10min直至清亮），暂不使用的样本需冷冻保存。
（三）饲料前处理方法----用均质器均质饲料样本；----称取1±0.05g均质样本至50ml离心管中，加0.1MHCL溶液10ml，用振荡器剧烈振荡5min，4000r/min以上离心10min；----取1ml上清液,加入20μl 1M 氢氧化钠溶液混匀（混匀以后测定pH值，大约为8）；---- 4000r/min离心5min；---将上清液用样品稀释液五倍稀释（即：1份上清液+4份稀释后的样品稀释液）并充分混匀----取20μl用于分析。
九、检测步骤测定前应须知：1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20～25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
操作步骤：1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本：加标准品/样本20μl/孔到对应的微孔中，再加入克伦特罗酶标物50μl/孔，再加入克伦特罗抗试剂80ul/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μl/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
7、显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应20～30min。
8、测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。
(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。
十、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，而定量判定用第2种方法。
注意样本吸光值与其所含克伦特罗成负相关。
1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。
假设样本1的吸光度值为0.569，样本2的吸光度值为1.725，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.523；0.05ppb为2.217；0.15ppb为1.566；0.45ppb为0.842；1.35ppb为0.387；4.05ppb 为0.145。
则样本1的浓度范围是0.45ppb～1.35ppb；样本2的浓度范围是0.05ppb～0.15ppb，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中克伦特罗的浓度范围。
2、定量分析（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝B×100%B0B—标准品或样本溶液的平均吸光度值B0—0(ppb)标准品的平均吸光度值（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。
将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际残留量。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
样本的稀释倍数：组织样品稀释倍数：3倍尿液稀释倍数：1倍饲料样品稀释倍数：50倍十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度试剂盒灵敏度：0.05ppb样本最低检测限：组织样品………………………………………0.15ppb 尿液样品………………………………………0.1ppb 饲料样品……………………………………2.5p p b 回收率：组织样品………………………………………80±10% 尿液样品…………………………………80±10%饲料样品…………………………………80±10% 精密度：试剂盒的变异系数均小于10%十二、注意事项1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。
所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。
标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。
0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450n m<0.5）时，表示试剂可能变质。
8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15～20min即可。
若颜色较浅，可延长反应时间到30min（或更长），但不得超过40min。
反之，则减短反应时间。
9、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十三、贮藏条件及保存期贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃。
保存期：该产品有效期为12个月。