elisa试剂盒
elisa试剂盒原理
elisa试剂盒原理ELISA试剂盒（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，又译作免疫夹配酶联免疫吸附测定法）是一种常用的生物化学技术，它能够快速、灵敏地检测固定量的抗原或抗体。
它的原理建立在具有特异性的抗原与抗体发生免疫反应的基础上，并且利用酶联免疫吸附测定法将其特异性特性发挥到极致。
ELISA试剂盒的原理实际上是利用一种可用来衡量两种特定分子结合情况的“酶联免疫反应”，即抗体可以特异性地结合抗原（如病毒、细菌、细胞、植物体等），然后会把这种特异性关联变成数量上的增加。
这种数量上的增加是金属蛋白酶（enzyme）所带来的。
当抗原被特异性抗体结合时，同时伴随着金属蛋白酶在抗原上的结合，而金属蛋白酶又被某些特定物（如丙二醛或氯仿等）所诱导，从而使抗原上的特异性结合物产生数量上的增加。
ELISA试剂盒的工作原理以上就是ELISA试剂盒的基本原理，它主要利用酶联免疫吸附测定的特异性原理，将特定的抗原或抗体酶联到具有特异性的样品上，最后检测数量上的增加。
ELISA技术具有高灵敏度、简便快捷、操作可靠等优点，被广泛应用于疾病诊断、抗原定性与定量检测、免疫活性评价以及生物体病原学研究等诸多领域。
ELISA试剂盒的工作原理主要包括抗原与抗体的结合、酶的结合与产物的检测等环节。
首先呈现的是抗原及抗体的结合，抗原及抗体在液体相中可以特异性地结合；其后的酶的结合是将抗原及抗体结合后，利用具有特异性的金属蛋白酶，将酶与抗原结合，从而使得结合物数量上有所增加；最后一步是检测，也就是检测酶结合物产生的数量上的增加，从而获取结果。
ELISA试剂盒的优势如下：1、ELISA试剂盒测定结果灵敏，且能够进行大规模检测；2、较快，能将一个检测过程缩短到几个小时；3、机器操作简单，操作步骤以及参数设置较为容易；4、一次可进行大量检测，可降低成本；5、器具配置简单，耗材容易获得，操作较为方便；6、安全性较高，可大幅减少辐射风险；7、节省时间和成本，跨学科的分析。
elisa试剂盒原理
elisa试剂盒原理Elisa试剂盒是一种用于检测特定蛋白质、抗体或其他分子的实验工具，其原理主要基于酶联免疫吸附法（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）。
这种方法通过将待检测物与特定抗体结合，再利用酶的催化作用来检测分子的存在和浓度。
下面我们将详细介绍Elisa试剂盒的原理。
首先，Elisa试剂盒的基本原理是基于抗体与抗原的特异性结合。
在Elisa试剂盒中，通常会将待检测的分子（如蛋白质）吸附在微孔板上，然后加入特异性抗体与待检测分子结合。
接着，用酶标记的二抗结合在抗体上，形成“夹心式”免疫复合物。
最后，通过加入底物，酶催化产生的产物与底物反应产生显色反应，从而可以通过光密度或颜色的变化来检测待检测分子的存在和浓度。
其次，Elisa试剂盒的原理还涉及到酶的催化作用。
在Elisa 试剂盒中，常用的酶包括辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
这些酶在特定底物的作用下可以产生显色反应，从而实现对待检测分子的定量检测。
而且，由于酶的高效催化作用，Elisa试剂盒具有高灵敏度和高特异性，能够检测到极低浓度的待检测分子。
此外，Elisa试剂盒还可以分为间接法、直接法、竞争法和夹心法等不同的类型。
在间接法中，待检测分子首先与固相抗原结合，然后再加入酶标记的二抗；在直接法中，待检测分子直接与固相抗体结合；在竞争法中，待检测分子与酶标记的抗原竞争结合；在夹心法中，待检测分子被两个抗体夹在中间。
这些不同类型的Elisa试剂盒可以根据实验需要来选择，以实现不同类型的检测要求。
总的来说，Elisa试剂盒的原理是基于酶的催化作用和抗体与抗原的特异性结合，通过特定的实验步骤和方法来实现对待检测分子的定量检测。
通过Elisa试剂盒可以快速、准确地检测各种生物分子，广泛应用于医学诊断、生物学研究、药物开发等领域。
希望本文介绍的Elisa试剂盒原理能够帮助大家更好地理解和应用这一实验技术。
ELISA检测试剂盒操作流程
ELISA检测试剂盒操作流程1.准备实验材料和试剂-检验样本：例如血清、尿液、细胞上清液等。
-ELISA试板：根据样本数量选择96孔或384孔的板。
- 试剂盒：包括标准品、washes缓冲液、检测抗体、底物等。
2.样本处理-对于血清等生物液体样本，可用离心将固体物质沉淀并分离下清液。
-样本需储存或运输途中应避免反复冻融。
3.实验板的板液处理-将实验板从包装中取出，将不需要的孔进行盖膜封闭。
- 根据试剂盒说明书，添加适量的板液（Coating Buffer）到每个孔中，使其充分覆盖孔内壁。
-封闭板液的孔，将实验板在2-8℃下放置静置一夜或在37℃下1-2小时孵育。
4.样本添加-倒掉盘液，用PBS或TBST洗板3次，去除残留物。
-将样本加到每个孔中，根据需要添加正样本、负样本和待测样本。
-注意每个样本的剂量和添加的体积，通过试剂盒说明书和实验设计标准控制。
5.抗体添加-清洗步骤同上，将洗板缓冲液加到孔中，重复3次。
-加入检测抗体，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-要确保抗体的浓度和添加的体积适宜。
6.洗涤-洗涤步骤同上，用洗涤缓冲液洗板，重复3次。
-每次洗涤时，将洗液完全加满孔，静置1分钟，然后倒出洗液。
-注意洗涤时间和洗涤次数的准确控制，以将非特异性结合物质彻底清除。
7.底物添加-清洗步骤同上，将洗液加到孔中，重复3次。
-加入底物，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-底物液体应完全覆盖孔底，防止反应过程中氧化。
8.反应停止-根据试剂盒说明书，将反应停止液加入到孔中，停止底物的反应。
-注意反应停止液的体积和浓度，以保证反应的准确停止。
9.色谱分析-用ELISA板读板仪读取各个孔的OD值。
-根据试剂盒说明书和实验设计的标准曲线确定样本中目标物质的含量。
-注意设置适当的控制组和标准曲线来保证测量结果的准确性。
总结：ELISA检测试剂盒的操作流程主要包括实验板处理、样本添加、抗体添加、洗涤、底物添加、反应停止和色谱分析。
elisa试剂盒原理
elisa试剂盒原理elisa（外来酶联免疫吸附）试剂盒是一种以酶联技术为基础的免疫检测方法。
其原理是通过抗原-抗体间的特异性结合作用，构成抗原-抗体复合物，利用酶的特异性而形成的酶-抗体复合物，使得复合物具有了酶的催化效应，在定比浓度的颜料中产生一定吸光度（A 值），根据不同比例的抗原抗体分子以及酶反应产物，表现出不同程度的吸光度，通过比较试验吸光度与对照吸光度，计算出试验项目的质量，从而进行免疫诊断。
elisa试剂盒包含了抗原、抗体、活性介质和酶等组分，当抗原抗体相互结合时，就会形成抗原抗体复合物。
当复合物中含有活性介质时，它可以使一种特定的酶有活性，这种酶可以将抗原和抗体中的某一物质催化变成另一物质，产生具有一定的吸光度的产物，这就是elisa试剂盒的基本原理。
由于elisa试剂盒的容易操作、易于对药物反应性能进行管理和检测，以及检测准确、结果可靠等优点，它成为目前应用最为广泛的免疫学技术之一，是诊断疾病和检测抗原抗体的有力工具。
elisa技术主要包括抗原和抗体合成、夹心板绘制、抗体复合物检测、抗原抗体结合度测定、夹心板读数以及抗原抗体关系分析等步骤。
抗原和抗体合成是elisa试剂盒的基础，抗原的合成需要通过特定的生物学方法，进行生化合成抗原。
例如，采用抗原特异性酶联反应，利用酶联酶/核酸复合物，将酶联酶与酶联荧光物质连接，形成目标抗原，即抗原-酶联物，而抗体则是通过免疫学方法合成，一般有外源抗体和内源抗体。
夹心板绘制是elisa试剂盒的重要步骤，一般有二层夹心板和三层夹心板。
在elisa试剂盒中，夹心板上先用特定抗原和抗体涂敷，然后用供试物质涂及其他化学反应的物质，当抗原与抗体结合时，夹心板上就会形成抗体复合物，对比定比浓度中的抗原抗体，产生一定的吸光度信号，并检测出病毒抗原或抗体存在的情况。
抗原抗体结合度测定和夹心板读数是elisa试剂盒最重要的步骤，其测定抗原抗体复合物的程度，从而计算出试验项目的质量。
ELISA试剂盒操作方法
ELISA试剂盒操作方法ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学试验技术，用于检测体内或体外的蛋白质、抗体、抗原等物质。
ELISA试剂盒是用于进行ELISA实验的一种常见装置。
下面将为您介绍ELISA试剂盒的操作方法。
1.准备工作a.预热-将试剂盒中的所有试剂预热到适当的温度，通常为室温至37°C之间。
b.样品处理-准备好待测样品，可以是血清、细胞上清液、组织提取物等。
如果样品中含有大量的蛋白质或杂质，可以进行样品处理，如稀释、蛋白质去除等。
c.标准品准备-试剂盒通常包含一系列浓度已知的标准品，用于制作标准曲线。
按照说明书的要求，用缓冲液或适当的稀释液将标准品稀释为不同浓度的工作液。
2.涂膜板的处理a.涂膜板选择-根据实验需求选择合适的涂膜板，通常有96孔、384孔等。
b.板钉定位-使用板钉或其他适当的方法将涂膜板固定在适当的工作台上。
c.预涂底物溶液加入-将试剂盒提供的预涂底物溶液加入涂膜板的孔中，注意保持各孔液面平整。
3.样品与试剂添加a.标准品和样品加入-按照实验设计的需要，将标准品和待测样品分别加入涂膜板的孔中。
b.阳性对照和阴性对照加入-根据试剂盒的要求，加入阳性对照和阴性对照。
c.洗涤液加入-在每次试剂或样品加入后，使用专用的洗涤液将孔洗涤，以清除无关物质。
4.反应与显色a.结合抗体加入-按照试剂盒说明书要求，加入适当的结合抗体，用于与待测物质结合形成复合物。
b.二抗加入-加入带有底物标记的二抗，与结合抗体结合形成复合物。
c.显色底物加入-加入含有适当底物的显色底物试剂，使底物与酶结合并发出信号。
5.反应停止与测量a.反应停止液加入-在适当的时间点，根据试剂盒的说明，加入反应停止液，停止底物的酶反应。
b.光密封膜或保护板加盖-加盖光密封膜或保护板，防止溶液蒸发或污染。
6.读取和数据处理a.读取吸光度-使用ELISA读板仪读取各孔的吸光度值。
ELISA检测试剂盒使用指南
ELISA检测试剂盒使用指南ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测体内特定抗原或抗体的存在和浓度。
ELISA检测试剂盒是用于进行ELISA实验的组合套装，包括抗体或抗原、酶标记物、底物、缓冲液等。
本文将介绍ELISA检测试剂盒的使用指南，以帮助用户顺利进行ELISA实验。
1.准备实验材料：-ELISA检测试剂盒：根据实验需要选择适当的ELISA检测试剂盒，确保其在储存和运输过程中无损坏。
-样本：准备需要检测的样本，如血清、尿液、组织提取物等。
确保样本的质量和浓度满足实验要求。
-微孔板：根据试剂盒的要求选择合适的微孔板，同时注意其质量有无污染。
-基本实验设备：如计量器、洗板机、显微镜等。
2.实验步骤：-取出储存在4℃的试剂，确保其达到室温（一般为20-25℃），再根据实验步骤进行下一步操作。
-预处理样本：根据试剂盒的说明书，进行样本的预处理，包括稀释、纯化、稳定化等步骤。
-加样：将样本按照试剂盒要求的体积加入微孔板中，通常每个孔需要加入100-200μL的样品。
-洗板：使用洗板机或手工操作，将孔中的杂质洗净。
洗板时应注意洗涤缓冲液的使用浓度和洗涤次数。
-加入特异性抗体：根据试剂盒的说明书，将稀释好的特异性抗体加入各孔中，确保操作的准确性和每孔的稀释倍数。
-洗板：重复第4步的操作，将未结合的抗体洗净。
-加入酶标记物：根据试剂盒的说明书，将稀释好的酶标记物加入各孔中，确保加入的量准确无误。
-洗板：重复第4步的操作，将未结合的酶标记物洗净。
-加入底物：将稀释好的底物加入各孔中，使其与酶标记物反应，生成可视化的颜色。
-终止反应：根据试剂盒的要求，在一定的反应时间后，加入终止剂停止反应。
终止剂的选择需符合试剂盒的要求。
-检测结果：使用酶标仪或目视观察检测孔中的颜色变化，通过测量吸光度或颜色强度来确定样本中目标物的浓度。
3.数据分析：-计算样本的结果：根据试剂盒的说明书，根据吸光度或颜色强度测量结果，计算样本中目标物的浓度。
酶联免疫试剂盒elisa原理(一)
酶联免疫试剂盒elisa原理(一)酶联免疫试剂盒（ELISA）原理解析什么是酶联免疫试剂盒（ELISA）？•ELISA是一种常用于生物医学研究和临床诊断的试验方法。
•它基于酶标记的免疫技术原理，用于检测样品中特定蛋白质、抗体或其他生物分子。
ELISA的工作原理ELISA试剂盒通常由以下几个关键组分组成：1.固相酶标板：通常为96孔板，内壁涂有特定的抗原或抗体。
2.标准品：已知浓度和活性的特定蛋白质，用于制作标准曲线进行定量分析。
3.样品：待测蛋白质或抗体的来源。
4.酶标记的二抗：特异性与待检测的目标蛋白质或抗体结合的二抗（抗体）。
5.底物：酶标记的二抗与底物反应产生可测量的信号。
ELISA的基本步骤ELISA通常包括以下几个基本步骤：1.准备：准备实验所需材料，包括试剂盒、样品和标准品等。
2.涂覆：将待检测抗原或抗体溶液加入固相酶标板孔中，并在静置条件下使其吸附于酶标板孔内壁。
3.阻断：加入一种阻断剂防止未被固定的表面结合位点与样品中非特异性蛋白质结合。
4.孵育：将样品、标准品和质控样品加入不同孔中，与固定在孔内壁的抗原或抗体发生特异性结合反应，并在适当的条件下进行孵育。
5.洗涤：用缓冲液洗涤孔中未结合的样品，以去除非特异性结合物。
6.检测：加入酶标记的二抗，与已结合的目标蛋白质或抗体发生结合反应。
7.洗涤：再次用缓冲液洗涤除未结合的酶标记的二抗。
8.底物作用：加入底物，使酶标记的二抗与底物发生化学反应，生成可测量信号。
9.停止反应：加入停止液停止底物的反应，防止信号进一步发展。
10.分析：使用光谱仪等设备测量反应产物的吸光度，根据标准曲线定量分析待测样品中目标蛋白质或抗体的浓度。
ELISA的优势与应用•ELISA具有高灵敏度和特异性，可用于检测多种生物分子，包括蛋白质、抗体、荷尔蒙等。
•它被广泛应用于临床诊断、药物研发、食品安全监测和环境检测等领域。
•ELISA可以定量检测目标生物分子，因此被广泛用于疾病诊断和监测治疗效果等临床应用。
ELISA试剂盒操作方法
ELISA试剂盒操作方法1.准备工作-将所需试剂和物质取出，并按照使用说明书中的要求进行储存和保存。
确保试剂完整无损，并严格遵守保存条件。
2.样品处理-根据试剂盒的要求，处理待测样品。
这可能涉及到稀释、离心、过滤等步骤，以确保样品符合试剂盒的要求。
注意避免样品的污染和损坏。
3.准备试剂和标准曲线-根据试剂盒的要求，准备所需的试剂和标准曲线。
试剂通常由酶标板和洗涤缓冲液组成。
标准曲线是用于确定未知浓度样品的参考标准。
4.酶标板涂层-先加入涂层抗体或抗原到酶标板的孔中，然后将其在室温下孵育一段时间。
这会使孔中形成抗原或抗体的层，以便后续的反应。
5.吸附溶液去除-将酶标板颠倒并用纸巾轻轻拍干，以将未吸收的溶液去除。
6.样品和标准品加入-根据试剂盒的要求，将样品和标准品加入到孔中。
同时留有几个孔作为空白对照。
注意将样品和标准品加入到正确的孔中，避免交叉污染。
7.孵育和洗涤-放置酶标板在孵育箱中（一般在37摄氏度）孵育一段时间，以促使样品中的目标物质与酶标记的抗体结合。
然后将液体从孔中洗涤掉，以去除未结合的物质。
8.酶标记的二抗加入-加入酶标记的二抗（通常是抗人IgG的辣根过氧化物酶）到酶标板中的每个孔中，使其与目标物质结合。
9.孵育和洗涤-将酶标板重新放回孵育箱中孵育，然后再次进行洗涤，以去除未结合的物质。
10.底物添加-向每个孔中加入底物，使其与酶发生反应，产生颜色的变化。
反应时间根据试剂盒的要求进行控制。
11.反应终止-加入反应停止液，停止酶的反应，防止进一步的颜色变化。
具体的反应停止方法要根据试剂盒的要求进行。
12.颜色的测定-使用酶标仪或光度计测量各个孔中颜色的强度，并将其与标准曲线上的标准值进行比较，以确定样品中目标物质的浓度。
以上是ELISA试剂盒的基本操作步骤。
不同的试剂盒可能略有不同的要求和步骤，因此在操作之前务必仔细阅读和遵守试剂盒的使用说明书。
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elisa试剂盒Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。
由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。
ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM 抗体ELISA检测。
目录1elisa试剂盒简介2优点3回收率4发展5使用方法6制备方法7影响8检测原理9操作步骤10试剂器材elisa试剂盒简介ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。
2优点一、高效、灵敏、特异的抗体；二、稳定的重复性和可靠性；三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体；四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型；五、节省实验经费。
3回收率elisa试剂盒回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少，回收率越高，如果作标液1PPM，就是1毫克/升，而作出标准数据为0.99毫克/升，就是说你的回收率是99%，这个与真实成分有密切的关系，说明方法的准确度。
比如水中总无机氯含量测定，样品水中含有无机氯20mg/L，取100mL 被测水样品，加入0.1mL浓度为10mg/mL的含无机氯标准样品，测定时忽略体积变化，如果测定出样品中无机氯为2.98mg/L，则认为回收率为99%。
4发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。
目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。
5使用方法1、血清：操作过程中避免任何细胞刺激。
使用不含热原和内毒素的试管。
收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。
2、血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。
1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
1000×g离心10分钟，取上清液。
5、保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。
尽可能的不要使用溶血或高血脂血。
如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。
不要在37℃或更高的温度加热解冻。
应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
6制备方法包括以下步骤：1)抗原表位的计算机筛选；2)抗原的制备；3)血清的采集；4)间接ELISA方法的建立；5)间接ELISA方法的敏感性和特异性验证；6)试剂盒的稳定性验证；7)对屠宰场进行临床检测。
该方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性合格、重复性好。
应用本发明制得的试剂盒能有效检出感染猪的戊型肝炎病毒，适用于大批量发病样本的检测，可用于猪戊肝的快速诊断，并预防、控制猪戊肝病毒的流行和阻断戊肝病毒由猪向人传播。
7影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。
以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。
近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。
HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。
多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。
酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml8检测原理ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。
将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。
然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa 试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。
9操作步骤方法一双抗体夹心法1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二间接法1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；2.次日洗涤3次；3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；5.37℃孵育35-60分钟，洗涤；6.’最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
10试剂器材试剂（1）包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克加蒸馏水至1000ml（2）洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15MKH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸馏水至1000ml（3）稀释液：牛血清白蛋白（BSA）0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。
（4）终止液（3M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。
（5）底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）:0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml0.1M柠檬酸（19.2克/L）24.3ml加蒸馏水50ml。
（6）TMB（四甲基联苯胺）使用液:TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml底物缓冲液（PH5.5）10ml0.75%H2O232μl（7）ABTS使用液:ABTS0.5mg底物缓冲液（PH5.5）1ml3%H2O22μl（8）抗原、抗体和酶标记抗体。
（9）正常人血清和阳性对照血清。
器材（1）聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl 及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
（2）小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
（3）4℃冰箱，37℃孵育箱。
11注意事项做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
实验条件的选择在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:（1）固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2）包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。
蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。
选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。
对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
（3）酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。
然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
（4）酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。
有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。
有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。