ELISA试剂盒实验教程
ELISA检测试剂盒操作流程
ELISA检测试剂盒操作流程1.准备实验材料和试剂-检验样本：例如血清、尿液、细胞上清液等。
-ELISA试板：根据样本数量选择96孔或384孔的板。
- 试剂盒：包括标准品、washes缓冲液、检测抗体、底物等。
2.样本处理-对于血清等生物液体样本，可用离心将固体物质沉淀并分离下清液。
-样本需储存或运输途中应避免反复冻融。
3.实验板的板液处理-将实验板从包装中取出，将不需要的孔进行盖膜封闭。
- 根据试剂盒说明书，添加适量的板液（Coating Buffer）到每个孔中，使其充分覆盖孔内壁。
-封闭板液的孔，将实验板在2-8℃下放置静置一夜或在37℃下1-2小时孵育。
4.样本添加-倒掉盘液，用PBS或TBST洗板3次，去除残留物。
-将样本加到每个孔中，根据需要添加正样本、负样本和待测样本。
-注意每个样本的剂量和添加的体积，通过试剂盒说明书和实验设计标准控制。
5.抗体添加-清洗步骤同上，将洗板缓冲液加到孔中，重复3次。
-加入检测抗体，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-要确保抗体的浓度和添加的体积适宜。
6.洗涤-洗涤步骤同上，用洗涤缓冲液洗板，重复3次。
-每次洗涤时，将洗液完全加满孔，静置1分钟，然后倒出洗液。
-注意洗涤时间和洗涤次数的准确控制，以将非特异性结合物质彻底清除。
7.底物添加-清洗步骤同上，将洗液加到孔中，重复3次。
-加入底物，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-底物液体应完全覆盖孔底，防止反应过程中氧化。
8.反应停止-根据试剂盒说明书，将反应停止液加入到孔中，停止底物的反应。
-注意反应停止液的体积和浓度，以保证反应的准确停止。
9.色谱分析-用ELISA板读板仪读取各个孔的OD值。
-根据试剂盒说明书和实验设计的标准曲线确定样本中目标物质的含量。
-注意设置适当的控制组和标准曲线来保证测量结果的准确性。
总结：ELISA检测试剂盒的操作流程主要包括实验板处理、样本添加、抗体添加、洗涤、底物添加、反应停止和色谱分析。
Elisa试剂盒操作方法
ELISA试剂盒操作方法Elisa试验广泛应用在免疫学检验的各领域中，那么Elisa试验有没有简单便捷的操作方法呢？ELISA试剂盒操作方法具体如下：ELISA试剂盒操作方法一:用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA试剂盒操作方法二：用于检测未知抗体的间接法：1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
次日洗涤3次。
2.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
（同时做空白、阴性及阳性孔对照）3.于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
4.于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟5.于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml6.可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
ELISA试剂盒操作方法
ELISA试剂盒操作方法ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学试验技术，用于检测体内或体外的蛋白质、抗体、抗原等物质。
ELISA试剂盒是用于进行ELISA实验的一种常见装置。
下面将为您介绍ELISA试剂盒的操作方法。
1.准备工作a.预热-将试剂盒中的所有试剂预热到适当的温度，通常为室温至37°C之间。
b.样品处理-准备好待测样品，可以是血清、细胞上清液、组织提取物等。
如果样品中含有大量的蛋白质或杂质，可以进行样品处理，如稀释、蛋白质去除等。
c.标准品准备-试剂盒通常包含一系列浓度已知的标准品，用于制作标准曲线。
按照说明书的要求，用缓冲液或适当的稀释液将标准品稀释为不同浓度的工作液。
2.涂膜板的处理a.涂膜板选择-根据实验需求选择合适的涂膜板，通常有96孔、384孔等。
b.板钉定位-使用板钉或其他适当的方法将涂膜板固定在适当的工作台上。
c.预涂底物溶液加入-将试剂盒提供的预涂底物溶液加入涂膜板的孔中，注意保持各孔液面平整。
3.样品与试剂添加a.标准品和样品加入-按照实验设计的需要，将标准品和待测样品分别加入涂膜板的孔中。
b.阳性对照和阴性对照加入-根据试剂盒的要求，加入阳性对照和阴性对照。
c.洗涤液加入-在每次试剂或样品加入后，使用专用的洗涤液将孔洗涤，以清除无关物质。
4.反应与显色a.结合抗体加入-按照试剂盒说明书要求，加入适当的结合抗体，用于与待测物质结合形成复合物。
b.二抗加入-加入带有底物标记的二抗，与结合抗体结合形成复合物。
c.显色底物加入-加入含有适当底物的显色底物试剂，使底物与酶结合并发出信号。
5.反应停止与测量a.反应停止液加入-在适当的时间点，根据试剂盒的说明，加入反应停止液，停止底物的酶反应。
b.光密封膜或保护板加盖-加盖光密封膜或保护板，防止溶液蒸发或污染。
6.读取和数据处理a.读取吸光度-使用ELISA读板仪读取各孔的吸光度值。
ELISA试剂配制及实验流程—BDY
E L I S A试剂配制及实验流程—B D YThe document was finally revised on 2021ELISA试剂配制及实验流程ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
以双抗体夹心法举例说明。
试剂配制：(1) 包被缓冲液 + 碳酸盐缓冲液)：Na2CO3NaHCO3加蒸馏水至1000ml。
（用时稀释成1x，加%BSA）(2) 洗涤缓冲液 0.15M PBST)：%Tween-20加在PBS缓冲液1000ml中。
PBS缓冲液：KH2PO40.27gNa2HPO4·12H2O 3.58gNaCl 8gKCl加蒸馏水至1000ml。
(3) 封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。
(4) 稀释液：牛血清白蛋白 %加PBS 缓冲液100ml。
(5) 底物缓冲液：Na2HPO4(无水L，带12结晶水L) 取柠檬酸(无水L，带1结晶水L) 取加蒸馏水至100ml。
(或Na2HPO4·12H2O 1.84g柠檬酸·H2O 0.51g加蒸馏水至100ml)(6) TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-TMB(2mg/ml水)底物缓冲液30% H2O 2总体积1ml。
TMB, 1mg/ml-DMSO溶解(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉） 0.004g底物缓冲液 10ml30% H2O2总体积10ml。
(8) 终止液(2M H2SO4)：在水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)，边加边摇。
操作步骤：1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每板的反应孔中加，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。
(简称洗涤，下同)。
ELISA试剂配制及实验流程
ELISA试剂配制及实验流程ELISA(酶联免疫吸附实验)是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在与浓度。
ELISA试剂是ELISA实验中的关键组成部分，正确配制试剂和正确的实验流程对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。
一、ELISA试剂的配制1. 背景缓冲液（Coat buffer）：该缓冲液用于包被酶标板上的抗原或抗体，并且用于洗涤步骤中的洗板缓冲液。
配制方法：将10 mL Tris缓冲液（100 mM，pH 9.6）加入0.15 g NaCl，搅拌溶解，最后加入一滴Tween-20或其他润湿剂。
2. 试样稀释液（Sample buffer）：该缓冲液用于稀释试样，使其适应ELISA实验的测量范围。
配制方法：根据试样的含量和要求进行合适的稀释，一般可选择PBS （含0.05% Tween-20) 来稀释。
3. 标准品（Standard）：该物质用于建立标准曲线，以根据样品的读数来确定样品中目标物的浓度。
配制方法：首先通过相关实验确定标准品的初始浓度，使用稀释液进行逐步的2倍稀释，以获得不同浓度的标准溶液。
4. 酶标抗体（Enzyme labeled antibody）：该抗体与目标物结合，可与酶底物发生反应产生荧光或颜色。
配制方法：根据抗体的浓度和信号放大的要求，将抗体稀释在稀释液中。
5. 底物液（Substrate solution）：在酶底物的作用下产生颜色，用于测定目标物的浓度。
配制方法：根据酶底物的要求和实验条件，按照相应的方法配制底物液。
二、ELISA实验流程1.包被抗原或抗体：加入适量的抗原或抗体至酶标板孔中，在4°C 下静置一夜或在37°C下孵育数小时，使其吸附到酶标板表面。
吸附后，将酶标板孔洗涤干净以去除未结合的物质。
2.阻断：将阻断液加入酶标板孔中，避免非特异性结合，阻断剂一般为牛血清蛋白、鱼胶蛋白等。
孵育一段时间后，洗涤酶标板孔以去除阻断液。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、实验目的本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）的操作，检测目标物质的存在与浓度，以实现对生物样本中特定抗原或抗体的定量分析。
二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 目标抗原或抗体样本3. 特异性一抗和二抗4. 辅助试剂：洗涤缓冲液、稀释缓冲液、底物和停止液5. 高精度微量移液器和相应的移液器头6. 高精度电子天平7. 显微镜和酶标仪三、实验步骤1. 预处理：将96孔ELISA板放置在实验台上，加入稀释缓冲液，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。
重复此步骤3次。
2. 样本添加：将待测样本加入96孔ELISA板中，每孔加入相同体积的样本。
3. 孵育：将ELISA板盖上密封膜，置于恒温箱中孵育一定时间，使样本中的抗原或抗体与固相特异性一抗结合。
4. 洗涤：将洗涤缓冲液加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。
重复此步骤3次，以洗去未结合的物质。
5. 二抗结合：将特异性二抗加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后盖上密封膜，继续孵育一定时间，使二抗与固相特异性一抗结合。
6. 洗涤：重复步骤4。
7. 底物添加：将底物加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后暗处孵育一定时间，使底物与二抗结合的酶发生反应。
8. 反应停止：加入停止液，终止底物与酶的反应。
9. 测量：将96孔ELISA板放入酶标仪中，根据实验要求选择相应波长进行测量。
记录各孔的吸光度值。
10. 数据分析：根据实验目的，利用标准曲线或其他方法，计算出目标物质的浓度。
四、实验注意事项1. 实验前需准备好所有试剂和材料，确保实验环境清洁和无尘。
2. 操作过程中需佩戴手套，避免污染样本和试剂。
3. 洗涤步骤中，确保洗涤缓冲液充分覆盖每个孔，且每次洗涤液倒掉后，孔内无残留液体。
4. 孵育和暗处孵育步骤中，需控制好时间和温度，以确保反应的充分进行。
5. 底物和停止液需按照说明书的要求配制和使用，避免使用过期或变质的试剂。
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2 PBS洗3次，每次3分钟。
具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。
将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl （TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。
用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
elisa 试剂盒操作步骤
操作步骤1．取出试剂盒室温平衡30min，取出血样放至室温。
2．配标准品：取150uL标准品加入150uL标准品稀释液稀释，依次稀释5次。
3．加样：分别于各反应孔中加入标准品50uL，样品40UL，标准品做复孔，样品做3孔。
4．分别于样品孔中加入10UL抗体。
5．标准品和样品孔中分别加入50uL链酶亲和素-HRP，盖上封板膜,轻轻震荡混匀，37℃温育60min。
6．配洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
7．洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200uL洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
8．显色：每孔先加入显色剂A 50uL，再加显色剂B 50uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色6min。
9．终止：每孔加入终止液50uL，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。
10．测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。
测定应在加终止液10min 之内进行。
22．保存结果，收拾桌面。
12．分析处理数据注意事项1. 取出板条前恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，其余不用试剂应盖好。
2. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
3．实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。
4．洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
5．试剂盒内试剂请在保质期内使用，不同批号试剂不要混用。
6．1000pg/ml以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。
大于1000pg/ml 的样品应以标准稀释缓冲液稀释后重做。
在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。
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结果
原理 酶免疫测定类型
类型
试剂 准备
酶免疫组化
酶免疫技术
均相酶免疫测定
酶免疫测定
非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
液相酶免疫测定
对照 标本 结果
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫 吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） ，简称ELISA。
化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
结果
原理
类型 试剂 准备
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备 特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可
对照 标本
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点， 因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式 。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相 抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标 抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA 测定多用此法。
结果
原理 2.2.6 捕获包被法测抗体
原理
类型 试剂 准备
对照 标本 结果
1. ELISA的原理 2. ELISA的类型 3. 试剂准备：免疫吸附剂
结合物 酶底物的准备 4. 对照设定 5. 标本的采取和保存 6. 结果判断
原理 1. ELISA的原理
类型 试剂 准备
对照 标本
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础: 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应 的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
原理
类型 试剂 准备
对照 标本 结果
ELISA的试剂准备A
固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但 空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度 高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近 。
对照
标本 结果
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用 同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
原理 2.2.4 竞争法测抗体
类型
试剂 准备
对照
标本 结果
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化 抗原时，可用此法检测特异性抗体。
原理 2.2.5 竞争法测抗原
类型 试剂 准备
原理 3.1.2 包被的方式
类型
试剂 准备
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的 是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团 间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量
对照 标本
、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通 常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
原理 1.1.2 特异性
类型
试剂 准备
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之 间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
对照 标本 结果
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
1.1.3 最适比例
原理
类型 试剂 准备
对照 标本 结果
原理 1.1.4 敏感性
类型 试剂 准备
对照 标本
原理
类型 试剂 准备
对照 标本 结果
3. ELISA的试剂(A、B、C三部分)
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的 底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液
原理
类型 试剂 准备
1.1 抗原抗体反应
1.1.1 可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态 平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab
对照 标本 结果
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示： K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。 高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上 非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗 体均能保持原有的结构和活性。
对照 检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。 标本
结果
原理 2 ELISA的类型
类型
试剂 准备
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent ）；
对照 （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；
类型
试剂 准备
对照 标本 结果
IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固 相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异 性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染 的早期诊断。
原理 2.2.7 ABS-ELISA法
类型 试剂 准备
对照 标本 结果
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；
标本 （3）酶反应的底物。
结果 可设计出各种不同类型的检测方法。
原理 2.2.1 双抗体夹心法测抗原
类型
试剂 准备
对照
标本 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ果
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就 可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
原理 2.2.2 双抗原夹心法测抗体
类型 试剂 准备
对照 标本
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标 本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间 接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关 键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合 适的标记方法。
结果
原理 2.2.3 间接法测抗体
类型
试剂 准备