ELISA操作步骤
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析生物样本中的特定蛋白质、抗体或其他分子。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂准备、样本处理、板涂覆、洗涤、标记物添加、洗涤、底物添加和测量等步骤。
二、实验前准备1. 准备所需试剂和材料，包括ELISA板、标准品、样本、缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等。
2. 检查仪器设备是否正常工作，如酶标仪、洗板机等。
3. 温度控制，确保实验室温度稳定在适宜的范围内。
三、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需要，配制适当的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三乙胺缓冲盐水）、BSA（牛血清蛋白）溶液等。
2. 标准品的稀释：根据实验要求，将标准品按照一系列浓度稀释，制备标准曲线。
四、样本处理1. 收集待测样本，如血清、尿液等。
2. 根据实验要求，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
五、板涂覆1. 取出ELISA板，将每个孔加入适量的涂层抗体或抗原，覆盖整个孔底。
2. 将板密封，放置在4℃的冰箱中，静置一夜或按照实验要求的时间。
六、洗涤1. 取出ELISA板，将涂层液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
七、标记物添加1. 向每个孔加入适量的标记物，与待测物相互作用。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，使标记物与待测物结合。
八、洗涤1. 取出ELISA板，将标记物液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
九、底物添加1. 向每个孔加入适量的底物液，使其与酶标记物反应。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，观察颜色的变化。
十、测量1. 使用酶标仪测量每个孔的吸光度值。
2. 根据实验设计和标准曲线，计算出待测样本中特定物质的浓度。
十一、数据分析与结果解释根据测量结果和标准曲线，进行数据分析和结果解释，得出实验结论。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA操作流程
ELISA操作流程前处理1．匀浆样本：取一定量（约100—150g）的样本进行匀浆，匀浆样本以无颗粒状为为佳.样本匀浆好以后再利用称样勺搅拌样本,以充分混合不同个体的样本,达到均质的效果。
2．称量样本：利用0.01g当量的电子天平称量相应的样本重量，误差尽量控制在±0.02g,以提高结果的准确度。
样本直接称取到50ml离心管中。
称量的样本应尽量称取匀浆效果比较好的样品.3．加入提取液：在相应的样本中加入对应的提取溶剂，溶剂的体积在条件允许范围内尽量精确。
4．提取或萃取：加入相应的提取溶剂以后,拧紧离心管盖，利用涡旋仪充分振荡样品,以样本与提取液充分混合为准。
具体时间可参考说明书所提供的方法时间要求。
5．离心：把处理好的样品对称放置在离心机中，盖上离心机盖门，直到听到离心机盖门关闭声音，按“离心”键进行离心,离心时间一般设为5min，离心速度一般设为4500rpm/min。
如果样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。
6．移取液体:利用加样枪移取对应的的溶剂液体至另一个容器中；如果需要吹干浓缩的样品,则移取到干净干燥的玻璃管中；如果是取下层进行分析的样品则移取全部上层液体，利用下层进行分析。
移取液体的时候请注意避免移取到不相关的液体层，以免造成污染。
7．浓缩吹干：先利用甲醇把氮吹仪的针头进行润洗，具体方法是先打开空气压缩机的开头，先通以少量气流，把装有甲醇的容量浸泡针头前端，浸泡时间约1-2s即可。
润洗针头后，把装有样品的玻璃管放在下面水浴锅的相对应的固定夹子上，再打开气流阀门，以能感觉到气流声音为准,再缓慢把针头伸到液面上方，以吹动液面为限，在浓缩吹干过程中应不断调整针头的高度，以节省吹干时间。
吹干的样品以没有液体流动的判定依据，亦可在吹干后再吹大约2—3min左右。
严禁在没有吹干的情况下就取下样品进行下一步操作.8．复溶：加入对应的复溶工作液后,再加入相应的除杂溶剂，利用涡旋仪振荡溶解，此步骤时间不宜过长，大约10s左右即可。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和测量生物样品中特定抗原或抗体的存在。
本操作规程旨在提供详细的操作步骤，确保ELISA 实验的准确性和可重复性。
二、实验材料和设备1. 96孔ELISA板2. 微量移液器和相应的移液器头3. 洗板缓冲液4. 样品（抗原或抗体）5. 标准曲线样品6. 酶标记的二抗7. 底物液8. 停止液9. ELISA板洗涤器10. 阅读器三、实验步骤1. 准备ELISA板a. 将96孔ELISA板放置在工作台上。
b. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL洗板缓冲液。
c. 轻轻振动ELISA板，使洗板缓冲液均匀分布，并将其静置5分钟。
d. 倒出洗板缓冲液，然后用纸巾轻轻拍干ELISA板。
2. 加入样品和标准曲线样品a. 将待测样品和标准曲线样品分别加入不同的孔中，每个孔加入100μL。
b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间（根据实验需要）。
3. 洗涤ELISA板a. 将ELISA板放入ELISA板洗涤器中。
b. 加入足够的洗板缓冲液，启动洗涤器进行洗涤。
重复此步骤3次。
c. 倒出洗板缓冲液，用纸巾轻轻拍干ELISA板。
4. 加入酶标记的二抗a. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL酶标记的二抗。
b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间。
5. 洗涤ELISA板a. 重复步骤3中的洗涤步骤。
6. 加入底物液a. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL底物液。
b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间。
7. 加入停止液a. 使用微量移液器向每个孔中加入50μL停止液。
8. 测量吸光度a. 将ELISA板放入阅读器中，设置波长和吸光度测量模式。
b. 测量每个孔的吸光度值，并记录下来。
四、数据处理和分析1. 绘制标准曲线a. 使用标准曲线样品的吸光度值绘制标准曲线图。
b. 利用标准曲线计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。
本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验操作步骤，确保实验结果的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 微孔板：96孔或其他规格，耐酸碱性能好。
2. 酶标板洗涤缓冲液：含有洗涤液的缓冲液。
3. 标准品：已知浓度的抗原或抗体。
4. 待测样品：需要检测的抗原或抗体样品。
5. 酶标记的二抗：与待测样品中的抗体相应的二抗。
6. 酶标记底物：用于检测酶活性的底物。
7. 停止液：用于停止酶反应的液体。
三、实验步骤1. 准备工作a. 将微孔板标记编号，确保正确记录每个孔的样品信息。
b. 准备所需的试剂和材料，确保其完整性和质量。
c. 预热酶标仪至适当的温度。
2. 涂覆抗原或抗体a. 向微孔板的每个孔中加入适量的抗原或抗体溶液。
b. 将微孔板置于4℃的冰箱中，孵育一夜或适当时间。
3. 洗涤步骤a. 倒掉微孔板中的液体，用酶标板洗涤缓冲液洗涤孔板。
b. 重复上述步骤3次，确保洗涤干净。
4. 加入待测样品和标准品a. 向微孔板中的相应孔中加入待测样品和标准品，每个孔的体积相同。
b. 将微孔板覆盖，并在适当温度下孵育一段时间。
5. 洗涤步骤a. 倒掉微孔板中的液体，用酶标板洗涤缓冲液洗涤孔板。
b. 重复上述步骤3次，确保洗涤干净。
6. 加入酶标记的二抗a. 向微孔板中的每个孔中加入适量的酶标记的二抗溶液。
b. 将微孔板覆盖，并在适当温度下孵育一段时间。
7. 洗涤步骤a. 倒掉微孔板中的液体，用酶标板洗涤缓冲液洗涤孔板。
b. 重复上述步骤3次，确保洗涤干净。
8. 加入酶标记底物a. 向微孔板中的每个孔中加入适量的酶标记底物。
b. 将微孔板覆盖，并在适当温度下孵育一段时间。
9. 反应停止a. 向每个孔中加入适量的停止液，停止酶反应。
b. 使用酶标仪读取吸光度值。
四、数据分析1. 绘制标准曲线：根据已知浓度的标准品的吸光度值，绘制标准曲线。
ELISA操作步骤
ELISA操作步骤酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
双抗体夹心法是ELISA的一种常见方法，也被称为间接ELISA。
该方法通过将待测抗原与特异性抗体结合，然后将该复合物夹在两种抗体之间，从而实现检测目标物的定量。
以下是ELISA操作步骤（双抗体夹心法）：1.准备所需试剂和设备，包括等量酶联免疫吸附试剂，洗涤缓冲液，检测抗体，底物液和浓缩液。
2.预先涂上酶标板：用特异性抗体溶液将酶标板的孔涂覆。
将抗体溶液加入每个孔中，然后在常温下孵育2小时或过夜在4°C下孵育。
孵育结束后，将溶液倒掉，然后用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的抗体。
3.加入待测样品：将待测样品加入酶标板中，然后在常温下孵育1小时。
孵育结束后，倒掉孵育液，并用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的样品。
4.加入检测抗体：将检测抗体加入酶标板孔中，然后在常温下孵育1小时。
检测抗体可以与目标物中的特异性抗体结合，并形成夹心复合物。
5.加入底物液：将底物液加入每个孔中，然后在室温下孵育20-30分钟。
底物液通常含有染色剂，当底物液与酶产生反应时，颜色会发生变化。
6.停止反应：在孵育结束后，加入停止液停止反应。
停止液会改变底物液的pH值，从而停止酶的反应。
这将保持颜色稳定，并允许结果的定量测量。
7.结果分析：使用酶标仪读取每个孔的吸光值。
这些吸光值可以用于计算样品中目标物的浓度。
通常，在酶标板上设置标准曲线，用于根据吸光值确定目标物的浓度。
8.清洗：在每个步骤之后，用洗涤缓冲液充分清洗酶标板。
洗涤的目的是去除未结合的试剂和非特异性物质，以确保结果的准确性。
9.数据处理和统计分析：根据读数结果计算样品中目标物的浓度，并进行统计分析。
常见的统计方法包括均值、标准差和方差。
以上是双抗体夹心法ELISA的一般操作步骤。
在实际操作中，可能会根据具体要求进行一些调整和优化。
同时，实验室安全操作规范和个性化要求也需要被遵循和注意。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、实验目的本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）的操作，检测目标物质的存在与浓度，以实现对生物样本中特定抗原或抗体的定量分析。
二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 目标抗原或抗体样本3. 特异性一抗和二抗4. 辅助试剂：洗涤缓冲液、稀释缓冲液、底物和停止液5. 高精度微量移液器和相应的移液器头6. 高精度电子天平7. 显微镜和酶标仪三、实验步骤1. 预处理：将96孔ELISA板放置在实验台上，加入稀释缓冲液，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。
重复此步骤3次。
2. 样本添加：将待测样本加入96孔ELISA板中，每孔加入相同体积的样本。
3. 孵育：将ELISA板盖上密封膜，置于恒温箱中孵育一定时间，使样本中的抗原或抗体与固相特异性一抗结合。
4. 洗涤：将洗涤缓冲液加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。
重复此步骤3次，以洗去未结合的物质。
5. 二抗结合：将特异性二抗加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后盖上密封膜，继续孵育一定时间，使二抗与固相特异性一抗结合。
6. 洗涤：重复步骤4。
7. 底物添加：将底物加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后暗处孵育一定时间，使底物与二抗结合的酶发生反应。
8. 反应停止：加入停止液，终止底物与酶的反应。
9. 测量：将96孔ELISA板放入酶标仪中，根据实验要求选择相应波长进行测量。
记录各孔的吸光度值。
10. 数据分析：根据实验目的，利用标准曲线或其他方法，计算出目标物质的浓度。
四、实验注意事项1. 实验前需准备好所有试剂和材料，确保实验环境清洁和无尘。
2. 操作过程中需佩戴手套，避免污染样本和试剂。
3. 洗涤步骤中，确保洗涤缓冲液充分覆盖每个孔，且每次洗涤液倒掉后，孔内无残留液体。
4. 孵育和暗处孵育步骤中，需控制好时间和温度，以确保反应的充分进行。
5. 底物和停止液需按照说明书的要求配制和使用，避免使用过期或变质的试剂。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、实验室准备1.确保实验室环境清洁、整洁，并消毒操作台面和仪器。
2.准备所需材料：ELISA板、酶标仪、洗涤液、稀释液、标准品、试剂盒、试管、移液管、显色液、终止液等。
3.确保试剂保存完好，过期试剂及时更新，避免使用失效试剂。
二、实验操作步骤1.实验板的涂覆（1）选择合适的ELISA板，根据所需实验的样品数量确定使用的孔板数量。
（2）将需要的涂覆抗原或抗体稀释至适当浓度，用1:1000的稀释液稀释。
（3）将稀释液孔板均匀涂覆，避免产生气泡和交叉污染。
（4）将涂覆好的板以适当温度、湿度下放置2-4小时，或过夜在4摄氏度培养箱中。
2.样品处理（1）收集样品并编号，避免混淆。
（2）将样品稀释至合适浓度，一般为1:100-1:1000。
3.加标准品和样品（1）将标准品按照一定比例稀释。
（2）将稀释好的标准品和样品加入涂覆好的ELISA板的对应孔中。
4.孵育孔板（1）将ELISA板密封，放置在适当温度下孵育，时间根据实验需要设定，一般为1-2小时。
（2）检查孔板中是否有泡沫或交叉污染，若有，请及时处理。
5.洗涤（1）将孔板固定在洗涤器上，加入洗涤液。
（2）按照洗涤液说明书上的步骤进行洗涤。
6.加酶标记二抗（1）将酶标二抗按照一定比例稀释。
（2）将稀释好的酶标二抗加入每个孔中。
7.孵育孔板（1）将ELISA板密封，放置在适当温度下孵育，时间根据实验需要设定，一般为1-2小时。
（2）检查孔板中是否有泡沫或交叉污染，若有，请及时处理。
8.洗涤（1）将孔板固定在洗涤器上，加入洗涤液。
（2）按照洗涤液说明书上的步骤进行洗涤。
9.加显色底物（1）将显色底物按照一定比例稀释。
（2）将稀释好的显色底物加入每个孔中。
10.显色反应（1）将ELISA板在适当时间内观察显色反应的结果。
（2）根据所用试剂盒的说明书，记录每个孔的颜色强度。
11.反应终止（1）根据试剂盒的说明书，使用终止液终止显色反应。
（2）终止反应后，可通过酶标仪读取各孔的吸光度值。
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Envirology ELISA试剂盒说明书
试剂盒内容物：
●Cry1Ab/Cry1Ac 抗体包被固相板
●Cry1Ab/Cry1Ac 阳性对照组
●Cry1Ab/Cry1Ac 酶结合物
●底物
未提供的物品：
●TPBS清洗缓冲液（PBS/0.05% Tween-20 wash buffer），常温保存，最多一年，然后丢弃。
●萃取缓冲液（PBS0.55% Tween-20）。
可以将0.5 ml Tween-20加入到100 ml 上一步的TPBS
缓冲液内制得。
不使用时放在冰箱内冷藏，ELISA分析时升至室温使用。
●HCL(1 Mol/L) 终止液。
将83 ml盐酸溶液（37%）到917ml蒸馏水或去离子水中制的。
配置过程在通风橱内操作。
室温下保存可使用2年。
●一次性吸管，可调节排气移液枪，记号笔，parafilm膜等。
实验步骤：
●此步在15min内完成。
加50ul 到板孔内，随即在相应板孔内进行如下操作，加50ul
萃取缓冲液作为空白对照，加50ul Cry1Ab阳性对照，加50ul样品萃取物到板孔内。
●在桌面上晃动96孔板20~30秒，使内容物充分混匀。
注意勿使内容物溅出！
●盖上盖子勿使水分蒸发，并在室温下孵化1~2小时。
如果有孔板摇床，可在200 rpm速
度下摇动孔板。
注意：根据组织萃取方法，用户应该决定一个合适的孵化时间，以使得到最佳结果。
●孵化结束后，小心移去盖子并将孔内液体甩到废水池内，要剧烈甩弃，尽量甩尽孔内液
体。
用TPBS清洗缓冲液清洗板孔（300ul/孔），然后甩尽缓冲液，3次重复。
●每孔加100ul底物。
●在桌面上晃动96孔板20~30秒，使内容物充分混匀。
盖上盖子室温下孵化15~30分钟。
●加100ul HCL(1 M)终止液，并且混匀。
此步能使孔内物质变黄。
注意：在加入终止液
后30分钟内读板。
读板：
●调节读板仪波长到450nm。
如果读板仪有双波长功能，可依据文献选600、630或者
650nm作为备选波长。
●设置读板仪空白项到空白对照孔。