DHE超氧化物阴离子荧光探针
叶黄素在眼科疾病中作用和机制的实验性研究进展
叶黄素在眼科疾病中作用和机制的实验性研究进展张薇;童念庭;尹莉莉;宫媛媛;吴星伟【摘要】Lutein has been proved to have the ability to remove singlet oxygen groups and peroxide radicals, and it protectshuman retina from injury through blue-light infiltration and antioxidation. Although the validity of lutein to prevent or treatvarious eye diseases has been revealed by clinical trials, the exact mechanism is not definitely known, which leaves room forclinical and laboratory researches. The laboratory research progress of roles and mechanisms of lutein in eye diseases isreviewed in this paper, and major eye diseases-associated animal models and cells in laboratory researches for lutein areintroduced.%叶黄素可清除单氧基团和过氧化自由基,对视网膜的保护机制主要体现为滤过蓝光和抗氧化损伤.叶黄素在多种眼科疾病中的预防及治疗作用虽被临床证明有效,但其机制尚未完全明确,有待临床与基础研究探索.文章对叶黄素在眼科疾病中作用和机制的实验性研究进展进行综述,主要介绍常见眼科疾病动物模型中和眼科相关细胞中叶黄素的研究.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】4页(P231-234)【关键词】叶黄素;动物模型;细胞实验;抗氧化【作者】张薇;童念庭;尹莉莉;宫媛媛;吴星伟【作者单位】上海交通大学医学院,上海200025;上海交通大学附属第一人民医院眼科,上海200080;上海交通大学附属第一人民医院眼科,上海200080;上海交通大学附属第一人民医院眼科,上海200080;上海交通大学附属第一人民医院眼科,上海200080;上海交通大学医学院,上海200025;上海交通大学附属第一人民医院眼科,上海200080【正文语种】中文【中图分类】R77叶黄素是一种氧化类胡萝卜素，属于类胡萝卜素中的黄色色素家族[1]，主要存在于深绿叶蔬菜(菠菜、羽衣甘蓝等)、玉米、蛋黄、水芹、豌豆以及橙子等。
胞内羟基自由基和超氧阴离子自由基测定
活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。
目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。
其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。
细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。
然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。
此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。
因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。
胞内羟基自由基测定机理：2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。
这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。
尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。
因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。
此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。
胞内羟基自由基测定方法：在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。
用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。
胞内超氧阴离子自由基测定机理：一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。
DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。
根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。
超氧化物阴离子荧光探针
超氧化物阴离子荧光探针
超氧化物阴离子荧光探针是检测和监测细胞氧化应激的有用的生物标记物。
它的应用不仅在药物研究领域受到广泛关注，还在高校与高等教育中有所作为。
超氧化物阴离子荧光探针是一种基于配体技术，它通过识别阴离子来实现，也可以用于检测和跟踪活性氧。
该技术可以检测正常细胞通常称为转氧单胞菌中的超氧化物阴离子，如过氧化氢、过氧化物和醛类分子。
他们都具有活性，有效地抑制细胞的正常功能。
当氧化应激发生时，超氧化物阴离子就会出现，测量一个细胞或细胞群体的超氧化物阴离子水平就可以反映出氧化应激的程度。
在高校和高等教育中，超氧化物阴离子荧光探针通常用于检测和监测细胞氧化应激，其中有一种称为Role OF ROS（细胞氧化应激角色）的方法可以帮助检测出氧化应激引起的负面影响，比如细胞早衰、炎症反应等。
超氧化物阴离子研究在高校和高等教育中受到大量关注，以及评估其在具体应用中的有效性。
当前，超氧化物阴离子荧光探针的最新进展可以发挥多重作用，不仅能够精准检测细胞氧化应激，而且还可以增强诊断和治疗效果，如显示出ROS诱导的抗肿瘤治疗有助于阻断癌症发展。
在高校中，超氧化物阴离子荧光探针能够帮助专业人员更好地理解氧化环境与细胞组织，进而做出正确的选择。
超氧化物阴离子荧光探针是药物研究和高校教育领域的重要工具，它以准确的信号强度测量细胞氧化应激的重要参数，因而是研究细胞的有效途径。
从氧化应激影响的分子机制和潜在的病理生物学机制，超氧化物阴离子荧光探针能够在高校中有一定的重要作用。
补骨脂酚经蛋白激酶Cε拮抗内皮细胞缺血再灌注损伤
补骨脂酚经蛋白激酶Cε拮抗内皮细胞缺血再灌注损伤王垒;杜朝升;肖军;杨健【摘要】目的研究补骨脂酚(BAK)对血管内皮细胞模拟缺血再灌注损伤(SIR)的保护作用及其分子机制. 方法用不同浓度BAK(2,5,10 μmol/L)预处理体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24h,接受模拟缺血再灌注(SIR)损伤(缺血45min,再灌注4 h),用CCK-8法和TUNEL法分别检测细胞活力和凋亡率,酶活性测定法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,细胞中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性,DHE荧光探针检测细胞中活性氧(ROS)的含量,Western blot法检测细胞膜PKCε、细胞质PKCε、Bcl-2、Bax、cleaved caspase 3和gp91 phox蛋白的表达水平.使用PKCε特异性阻断剂εV1-2阻断该信号通路,进一步探究PKCε信号通路在其中的作用. 结果 BAK预处理呈剂量依赖性地改善内皮细胞SIR损伤,且10 μmol/L剂量效果最佳.BAK预处理可明显提高缺血再灌注损伤后内皮细胞活力,减少LDH释放,增强细胞中SOD活性,降低MDA含量及gp91 phox蛋白表达量,减少ROS的产生;促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制凋亡蛋白cleaved caspase 3,Bax的表达,降低再灌注损伤后细胞凋亡率;并且显著促进PKCε膜转位,而特异性阻断PKCε信号通路可逆转BAK的上述保护作用(均P＜0.05). 结论 BAK通过激活PKCε信号通路,进而增强细胞抗氧化应激和抗凋亡能力,最终缓解内皮细胞缺血再灌注损伤.%Objective To explore the protective effects of bakuchiol(BAK) against simulated ischemia reperfusion(SIR)-induced injury in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) and its underlying mechanisms.Methods The cultured HUVECs were pretreated withBAK(2,5,10 μmol/L) for 24 h and then subjected to SIR (45 min ischemia,4 h reperfusion).Cell viability and apoptotic index were detected by CCK-8 andTUNEL methods,and the lactate dehydrogenase (LDH)releasing,intracellular malondialdehyde(MDA) content,superoxide dismutase(SOD) were all assessed by specialized kits.The translocation of protein kinase C epsilon (PKCε) and the expression levels of Bcl-2,Bax,cleaved caspase 3 and oxidative stress marker gp91phox were detected by Western blot.Dihydroethidium (DHE),a fluorescence probe,was used to detect the presence of reactive oxygen species (ROS).The εV1-2,a specific inhibitor of PKCε signaling,was used to further study the role of PKCε in this process.Results BAK pretreatment protected HUVECs against SIR injury in a dose-dependent manner,especially at the concentration of 10 μmol/L.BAK pretreatment significantly improved the cellviability,reduced LDH releasing,up-regulated the SOD activity and down-regulated the MDA content of SIR-treated HUVECs (P ＜ 0.05).In addition,BAK supplementation significantly reduced the apoptotic index,increased PKCε translocation and Bcl-2 expression,and decreased the expression levels of cleaved caspase 3,Bax and gp91phox(P ＜0.05).However,the protective effects of BAK mentioned above were significantly attenuated by εV1-2 (P ＜ 0.05).Conclusion BAK pretreatment can protect against SIR-induced oxidative stress and apoptosis on HUVECs via PKCε signaling pathway.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2017(048)010【总页数】7页(P975-981)【关键词】补骨脂酚;人脐静脉内皮细胞;缺血再灌注损伤;蛋白激酶C epsilon;氧化应激;凋亡【作者】王垒;杜朝升;肖军;杨健【作者单位】军委机关事务管理总局北极寺老干局门诊部内科,北京100191;中国人民解放军第518医院内科;中国人民解放军第309医院心血管内科;中国人民解放军第313医院心血管内科【正文语种】中文【中图分类】R363缺血性心脏病严重危害当今社会人类生命健康,其首要治疗策略是及时恢复缺血心肌的血流灌注,然而血流再灌注易加重心肌组织结构损伤及能量代谢障碍,诱发心肌缺血再灌注损伤[1, 2]。
DHE-ROS活性氧的检测
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
荧光显微镜检测： 1、 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取 25-50 μl 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。 2、 荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS 阳性细
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咨询邮箱：bestbio@
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电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式
细胞仪检测； ● 背景低，灵敏度高； ● 线性范围宽，使用方便。
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本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
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胞在整个核区被染成红色；用紫外光激发时，胞浆中未氧化的二氢乙啶可发出 蓝色荧光。
流式细胞仪分析： 1、 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。 用 0.5~1 ml 冰冷 PBS 重悬细胞（5~10 万）。 2、 采用 480~535 nm 波长激发，测定 590 nm~610 nm 以上的发射，细胞应可分成两个 亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的红色荧光。
超氧阴离子自由基荧光探针的研究进展
二苯 基 异 苯 并 呋 喃 结 合 可 以 作 为 检 测 ０ ・
或 ０ 的荧光指示器 。
２３ ２一（ ． ２一吡啶基 ） 并噻 唑啉 苯
不强， 水溶性与生物兼容性不容易兼有 ， 生物体系的
背景荧光干扰 等。特别是能实现细胞内某一区域的 超氧阴离子 自由基检测的理想 的荧光探针还未见报
倍 ・ Ｈ共存下无 干扰 ， Ｏ 为医学 临床上监测病变组
织内超氧阴离子 自由基提供了新的方法。
２７ 香草醛 缩苯 胺荧 光 探针 ．
红色荧光 ； 其次 Ｈ Ｅ的浓度偏高不仅导致荧光增强 ，
而且能促进超氧阴离子岐化成 Ｈ Ｏ Ｌ 。因此该方 ： ２ 引 法不能准确地定量检测超氧阴离子 自由基。
氧 如图 １ 所示 ， 其产生最早 的为 Ｏ ・ － ￣说它 ，Ｉ ｎ － 是导致 自由基连锁反应 的初始物质 是体内其它 引， 活性 氧 的主要 来源 引。
是三种具有代表性 的活性氧 自由基… ， 这些 自由基 及其活性衍生物 ［ 如脂质 （ Ｈ） 氧化 的产物 （ Ｏ Ｌ 过 Ｌ Ｌ ０・ Ｌ Ｏ ］ Ｏ 及 Ｏ Ｈ） 在体内不断产生， 同时也不断 被生物体的防御体系所 清除， 因此它们被维持在一 个极低的、 有利无害的水平 。但在特殊情况下 ， 如受 到氧化胁迫时， 这些活性 自由基 就能诱 发一系列损 伤机体的反应 ， ］从而导致相关疾病 的产生。许 多 研究表明， 活性氧 自由基在生物体的衰老与疾病 ， 以
ｓ ｎ ｆ ａ ｃ ． ｅ ｐ ｅ ｅ ｔ ｄ ｔ ｅ ｄ ｓｇ ，ｓ ｎ ｅ ｉ ，ａ ｄ ａ ａｙ ｉ ｆ ｔ ｅ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｒ ｂ ｏ ｕ ｅ ｘ ｄ ｉ ｉｃ ｎ ｅ Ｗ ｒ ｓｎｅ ｈ ｅｉ ｇ ｉ ｎ ｙ ｔ ｓｓ ｎ ｎ ｓ ｏ ｈ ｕ ｒ ｓ ｅ ｔ ｐ ｏ ｅ ｆ ｒ ｓ ｐ ｒ ｉ ｅ ｈ ｌ ｓ ｌ ｏ ａ ｉｎ ｒ ｄ ｃ １ ｎｏ ａ ｉａ．
dhe染色原理
DHE染色原理DHE染色法是生物学领域常用的染色试剂。
它能够帮助科学家对细胞进行染色，并进一步研究细胞结构和基因组成。
本文将向您介绍DHE染色的原理和应用。
1. DHE染色原理DHE全称为2',7'-二羧基二氢荧光素，是一种氧化还原指示剂。
DHE与活性氧自由基O2·-作用时会发生氧化反应，转化为紫罗兰色荧光产物。
由于细胞膜通透性，DHE可穿过细胞膜，并被细胞内的O2·-所氧化。
因此，DHE染色法常用于研究O2·-的产生与炎症反应相关的细胞行为和信号转导通路。
2. DHE染色的应用DHE染色法广泛应用于心血管疾病、免疫病理学、神经生物学、药理学等多个领域，如：2.1 心血管疾病DHE染色法可用于研究心血管疾病中内皮细胞O2·-的产生和氧化应激。
内皮细胞是心血管系统中的一个重要组成部分，有着维持心血管系统功能的重要作用。
研究表明，内皮细胞中O2·-的过度产生与心血管疾病的发生和发展密切相关。
2.2 免疫病理学DHE染色法可用于研究免疫细胞中的活性氧自由基和免疫反应的关系。
免疫细胞中的O2·-不仅参与着免疫细胞功能的调节，还参与了炎症反应和免疫细胞走向死亡的过程。
2.3 神经生物学DHE染色法可用于研究神经退行性疾病中神经细胞O2·-的产生。
神经退行性疾病是一类严重损伤中枢神经系统的疾病，研究表明其中神经细胞的氧化损伤与O2·-有关。
2.4 药理学DHE染色法可用于研究药物对细胞氧化应激的影响。
作为一种敏感的荧光探针，DHE可以用于筛选治疗氧化应激相关疾病的药物。
3. 结语DHE染色法作为一种灵敏而有效的细胞染色试剂，为生物学领域提供了重要工具。
它不仅可以研究氧化损伤相关疾病的发生和发展机制，还可以用于药物筛选和发现。
组织ROS及超氧化物检测
A: DCFH-DA法:测得是总活性氧,但对超氧化物不是非常灵敏.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:500用无血清培养液稀释DCFH-DA(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在488nm激发波长，525nm发射波长处观察荧光信号.
注A::
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去? 没有胎鼠组织的话建议选择母鼠的脑及肝作为预试组织。
DHE法: 测的是超氧化物.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:200用无血清培养液稀释DHE(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在535nm激发波长，610nm发射波长处观察荧光信号.(或者300nm激发波长，610nm发射波长)
注B:
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去?
3.DHE与超氧化物反应后的产物有毒,操作过程中需要防护(戴手套,防止污染台面),用过的皿及枪头等垃圾建议分类处理.。
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Dihydroethidium (DHE)—超氧化物阴离
子荧光探针
呼~深吸一口气，你感受到了什么？
饱含O2的气流，进入肺部，通过交换进入血液，再运输至全身各处，于是一种愉悦的情绪开始从身体内部升起、蔓延……
这种深呼吸带来的安定感，除了供氧充足外，还没有给出特别合理的解释，只有斯坦福大学的一支团队给我们带来了一点启示，他们发现在小鼠脑干深处，有一群微小的神经元集群，它们将呼吸与放松、关注、兴奋和焦虑联系起来，连结着大脑的唤醒中心，可调节情绪状态。
这个发现也许能给呼吸与情绪的关系带来一定的启发，毕竟呼吸是那么的重要，它伴随着我们的一生，当然，任何过程都伴随着小小的隐患。
一个成年人一天大概需要0.75公斤的O2，氧分子在代谢过程中可能被单个电子还原，形成中间产物超氧阴离子O2-，其性质活泼，易与多种大分子结合使其失去活性。
生物体正常代谢过程和在各种环境胁迫下均能产生超氧化物，它们的积累将引起生物体内细胞结构和功能的破坏。
人体内正常有一套活性氧清除系统，但在某些疾病的影响下，会出现氧化应激现象（即氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化），超氧化物增多，所以在科研及疾病诊断中可以通过检测超氧化物的含量，来反应呼吸及疾病程度。
为此我们需要用到可以特异性识别超氧化物的产品——Dihydroethidium (DHE)就是我们今天的主角。
Dihydroethidium (DHE)是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针,能有效地检测活性氧类。
这种染料可以自由地进入细胞，在细胞内超氧化物阴离子作用下脱氢形成溴化乙锭。
溴化乙锭可
以与RNA或DNA结合产生红色荧光。
当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的溴化乙锭较多，红色荧光就较强，反之则较弱。
这样就可以用二氢乙锭进行超氧化物阴离子水平的检测。
在下面这篇文章中我们可以看到具体的DHE的应用。
这是一篇探究体外培养的CD34+细胞在缺氧和常氧状态下，抗氧化酶和谷胱甘肽氧化还原状态的变化的文章。
文章用DHE标记了超氧化物O2-，上流式进行检测。
结果表明，氧含量对于超氧化物和过氧化物的生成有影响，常氧状态下，过氧化物的生成比率更高，含有2mM Nac（N-乙酰半胱氨酸，谷胱甘肽的前体）时，超氧化物和过氧化物的水平接近于缺氧时的水平，所以得出结论，Nac的含量可以影响体内活性氧水平。
该文章的探究，正是运用了DHE对于超氧化物阴离子O2-的荧光标记作用，该探针已经广泛地用于NK细胞、中性粒细胞、内皮细胞、细胞HL60和巨噬细胞的研究，并且作为一种重要的染料用于鉴定肿瘤中细胞的增殖和低氧性。
爱必信生物可为您提供高品质的DHE（abs810256）用于超氧化物阴离子的标记，DHE可以溶解于DMSO，配制成适当的母液。
常用浓度为0.5-5uM与细胞37℃孵育30min进行装载，之后可以上流式细胞仪或其他荧光检测仪器进行检测。