实验十八 血清胆红素测定(改良J-G法).pptx
血清总胆红素及结合胆红素测定PPT优秀课件
【试剂】
1．0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2) 称取三羟甲基氨基甲烷 (Tris)1.211g，胆酸钠172.3mg,十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg， 溶于去离子水90ml中，在室温(25～30℃)用1mol/L盐酸调节pH至 8.2(约用6ml)，再加蒸馏水至100ml，置冰箱保存，此液含 4mmol/L胆酸钠、15mmol/L SDS。
4．总胆红素标准液(342μmol/L) 按胆红素测定J-G法中方法配制，或 市售合乎要求的标准液。
5．结合胆红素标准液 将DTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中， 或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，－70℃保 存，可稳定6个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定1年。
【操作步骤】
• (3) 新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。
• (4) 再生障碍性贫血及数种继发性贫血(主要见于癌或慢性 肾炎引起)，血清总胆红素减少。
【临床意义】
2．血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素 与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。
• (1) 比值＜20% 溶血性黄疸，阵发性血红 蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。
2．0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)。
3．BOD溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜 过长(约可保存1周)，如系液体(可能含有甘油)，置4℃冰箱可保存较 长时间，BOD贮存溶液的酶活性一般在数千至1万～2万U/L，BOD 工作液酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.3～1.0U/ml计算。
•
【操作步骤】 1.样品的测定 取3支试管，按下表程序操作.
混匀后，波长600nm，对照管调零，读取吸 光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。
改良J—G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素的问题探讨
改良J—G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素的问题探讨作者：叶章发张超桂远望来源：《中国实用医药》2014年第30期【摘要】目的分析改良J-G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素存在的问题。
方法使用改良J-G法分别检测患儿血清、稀释血清以及使用亚硝酸盐法检测血清胆红素项目，进行统计、分析。
结果改良J-G法检测总胆红素、间接胆红素，血清与稀释血清检测结果之间差异有统计学意义（P0.05）。
结论使用改良J-G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素时，必要时应稀释血清进行检测，以免影响检测结果的可靠性。
【关键词】改良J-G法；新生儿溶血病；血清胆红素在临床实验中发现，使用改良J-G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素，当其黄疸较为严重时，实验检测结果存在一定问题，现报告如下。
1 材料与方法1. 1 标本来源本院排除其他严重疾病、且黄疸较为严重的新生儿溶血病患者血液标本51例，其中男28例，女23例。
1. 2 仪器 OLYMPUS AU-2700全自动生化分析仪。
1. 3 试剂①国内某品牌改良J-G法总胆红素检测试剂。
试剂1：盐酸0.7 mol/L ，对氨基苯磺酸20 mmol/L ，柠檬酸0.7 mol/L，咖啡因 0.18 mol/L。
试剂2：亚硝酸钠溶液20mmol/L。
②国内某品牌改良J-G法直接胆红素检测试剂。
试剂1：盐酸0.3 mol/L ，对氨基苯磺酸30 mmol/L 。
试剂2：亚硝酸钠溶液10 mmol/L。
③兰森生物技术有限公司公司提供总胆红素、直接胆红素亚硝酸盐法检测试剂。
RANDOX（Human-Sera分析用人血清基质）定值冻干质量控制血清。
1. 4 方法由儿科护理人员使用真空采血管，采集患儿股静脉血液3.00～5.00 ml，及时送检验科处理备用。
首先，准确吸取离心处理后的血清0.25 ml，使用生理盐水倍比稀释，稀释至根据肉眼观察颜色，判断其大致在正常人血清总胆红素参考值上限水平；然后，分别吸取血清0.25 ml、各管稀释血清0.25 ml，放置各自检测试管中，上机进行改良J-G法胆红素项目实验检测；同时，血清标本进行亚硝酸盐法胆红素项目检测。
血清胆红素ppt课件.ppt
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
孕妇黄疸
列举几种常见的妊娠期黄疸性疾病： 一、先兆子痫毒血症：发生在孕妇妊娠20周以后，先兆子痫只 是在疾病进展时才累及肝脏。先兆子痫可有ALT升高，除非合 并DIC，黄疽少见。肝组织正常，或有出血性坏死，但无炎症。 二、妊娠期肝内淤胆症：以全身上下瘙痒、淤胆的生化改变为 特征。发生于妊娠中、末期，先有皮肤瘙痒，继而出现黄疸， 直接胆红素为主。血清胆固醇、胆酸、ALP和γGT升高，而ALT 正常或轻度升高。瘙痒和黄疸常在分娩后2周内消失，再次妊娠 再次发作。 三、妊娠急性脂肪肝：罕见的致死性疾病，常发生在妊娠后期， 好转的病例可完全恢复，再次妊娠时罕见再发。起病急剧，常 有上腹部剧痛、淀粉酶增高、类似急性胰腺炎。常有重度黄疸， 血清胆红素增高，而尿胆红素阴性。20%～40%的病例伴有先 兆子痈。重症病人实验室检查可有肝衰竭、急性肾功衰竭或弥 漫性血管内凝血(DIC)的表现。肝脏B型超声检查呈脂肪肝波形。 如果携带乙肝病毒的孕妇发生这种情况，因HBsAg(+)易被误诊 为暴发性乙型肝炎。
4.粪胆原: 尿胆原大部分从粪便排出,称为粪胆原。
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
5.胆红素肠肝循环 小部分胆红素经肠道吸收,通过门静脉回到肝内,其中
大部分再转变为结合胆红素,又随胆汁排入肠内,形成胆 红素肠肝循环。
引起黄疸。
阻塞性黄 疸根据阻 塞的部位 可分为肝 外胆管及 肝内胆阻 塞两类。
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实验十八血清胆红素测定(改良j-g法)
实验十六血清胆红素测定（改良J-G法）【目的】1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。
【原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。
醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
【器材】试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。
【试剂】1．咖啡因试剂称取无水水醋酸钠，苯甲酸钠，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2），溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。
过滤后置棕色瓶，室温保存。
2．碱性酒石酸钠溶液称取氢氧化钠，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O），用去离子水溶解并补足至1L，混匀。
置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L亚硝酸钠溶液称取亚硝酸钠，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于2周。
若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O），溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。
5．重氮试剂临用前取上述亚硝酸钠溶液和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。
6．L叠氮钠溶液7．胆红素标准液（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。
取过滤后的血清1ml，加入新鲜L NaCl溶液24ml，混合。
在414nm波长，1cm光径，以L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于；在460nm的吸光度应小于。
血清直接胆红素测定
血清立接胆红素测定1.实验原理在PH3左右、有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红素容易被矶酸盐氧化成胆绿素，而间接胆红素不能。
在450nm （胆红素吸收峰）处监测反应。
矶酸盐氧化前后吸光度的下降与样品中胆红素的浓度成正比。
由此可计算出样品中直接胆红素浓度。
2.标本：2.1病人准备：无特殊要求。
最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。
2.2类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3.标本存放：15〜25℃保存可稳定2天；2〜8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4.标本运输：常温条件下避光保存运输。
5.标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。
6.实验材料6.1试剂：上海欧泰克直接胆红素试剂盒6.L 1试剂组成酒石酸盐缓冲液100mmol/L表面活化剂I 适量磷酸盐缓冲液10 mmol/L矶酸钠盐 4 mmol/L6.1.2试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2〜8C,若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为18个月。
试剂2必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.4变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5注意事项：此试剂为体外诊断用。
警告！腐蚀剂！不要入口。
避免和眼睛，皮肤或衣服接触。
如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟。
接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。
6.2校准品：使用罗氏复合校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6. 3质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7.仪器：日立7060生化分析仪8.操作步骤8.1项目基本参数：参见生化检验日立7060生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2仪器操作步骤：参见生化检验日立7060生化分析仪操作规程.SOP文件检验结果的判断与分析10.质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与H 质控做为未知标本进行分析，以2s为质控警告限，3s为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
尿胆红素改良J-G法定量测定
尿胆红素（改良J－G法定量测定）工艺简介一、检测目的胆红素是血红蛋白的代谢产物，来源有三：（1）人体内胆红素的3/4源于循环血液中衰老红细胞崩解后所释放出的血红蛋白辅基血红素降解而产生；（2）骨髓中的红细胞原位溶血所释放的血红蛋白；（3）含卟啉的血色蛋白如肌红蛋白和其他非血红蛋白性的正铁血红素分解后产生极少量胆红素。
血红蛋白被单核-巨噬细胞系统破坏后分解成胆绿素，再还原成胆红素进入血与血浆白蛋白结合而被运转，称为非结合胆红素或间接胆红素；间接胆红素难溶于水，不能由肾脏排出而进入肝脏，受肝内葡萄糖醛酸基转移酶的作用与葡萄糖醛酸结合，形成葡萄糖醛酸酯，称为结合胆红素或直接胆红素。
结合胆红素由肝随胆汁排至肠道，被还原成粪胆原（尿胆原）再经氧化变成粪胆素（尿胆素），大部分随粪便排出体外；小部分经门脉吸收回肝，复经肝肠循环，其中一小部分进入血循环，经肾排出，称尿胆原。
当肝细胞损伤，胆管阻塞，红细胞破坏增加或寿命缩短时，胆红素代谢发生异常，临床上即出现黄疸。
二、反应原理尿液与醋酸钠-咖啡因-苯甲酸钠试剂混合后，加入偶氮苯磺酸，生成紫色的偶氮胆红素。
其中醋酸缓冲液用以保持偶氮反应的PH，咖啡因、苯甲酸钠加速偶氮苯磺酸的偶联反应。
抗坏血酸破坏剩余偶氮试剂，终止偶氮反应。
最后加入强碱性酒石酸溶液使紫色偶氮胆红素变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长下比色,测定蓝色偶氮胆红素的生成量。
三、试剂1．咖啡因-苯甲酸钠试剂无水醋酸钠41g，苯甲酸钠37.5g，EDTANa20.5g，溶于约500mL的蒸馏水中，再加入咖啡因25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加蒸馏水稀释至1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中。
作用：非结合胆红素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。
醋酸缓冲液用以保持偶氮反应的PH。
2. 5g/L亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠 5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至1000mL，若发现溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。
干式生化中的胆红素精品PPT课件
1
内容
一、胆红素的分类 二、检测方法介绍 三、新检测方法的临床应用
2
广医四院
胆红素的分类 -----不同方法对胆红素的分类
3
广医四院
胆红素的分类 -----分子结构上真实的胆红素分类
HPLC法
4
广医四院
胆红素的分类
5
广医四院
胆红素的分类
6
广医四院
胆红素的分类
7
27 广医四院
胆红素组分的临床应用
成功的肝胆梗阻再通后
100
Bu
Bc
Bdelta
Direct
Treatment
50
% 总胆百分比
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Days
28 广医四院
胆红素下降百分比
29 广医四院
结合胆红素
直接胆红素
结论
真实的结合胆红素检测优于直接胆红素 Bc对于进展性或恢复性胆道郁积的鉴别诊断比直接胆
10 广医四院
Vitros胆红素检测方法
11 广医四院
BuBc 干片
目的: 避免溶血的干扰
吸血光红度蛋白为红色，影响检测重氮胆红素的 血红蛋白具有酶解离重氮胆红素的作用 但其颜色正好与其酶作用相反，增加比色
的吸光度
12 广医四院
溶血标本对胆红素检测结果的影响
13 广医四院
溶血会使低TBil升高（颜色）， 但使高TBil降低（酶解）
p胆汁淤积会加快δ胆红素的形成
广医四院
胆红素的检测方法
胆红素检测方法发 展历程
8
广医四院
胆红素检测方法发 展历程
血清胆红素测定
血清胆红素测定病人准备：病人准备除了特殊检验有专门规定外，一般要求病人处于安静状态，生活饮食处于日常状态，目前已公认过度空腹、饮食、饮酒、吸烟及姿势体位等可影响某些检验结果，现分述如下：1. 运动：肌肉活动的影响可分短暂性的和持续性的两类，短暂性影响为血浆脂肪酸含量，可因运动而暂时减少，而后渐渐增加而恢复。
丙氨酸可因运动暂时增加达180%，受到持续性影响主要是一些与肌肉有关的酶，如肌酸激酶、乳酸脱氢酶等，据称一场60min的手球训练赛后11h，肌酸激酶活性比赛前仍增加达125%，长期坚持体育锻炼还会提高性激素水平，因此采血前宜安静，不作过大的活动。
2. 食物：进餐后血浆脂肪、蛋白质、糖类有所增加。
有人研究于高脂餐后2-4h采血，多数人碱性磷酸酶含量增高，主要来自肠源性同工酶，且与血型有密切关系，O型或B型兼为Le+分泌型者增高更明显。
一般认为高蛋白质餐使血浆尿素增加，但不影响肌酐含量，高比例不饱和脂肪酸食物，可减低胆固醇含量；食物如含有动物血液，可引起粪隐血假阳性。
故在做相应检验时，应对食物有一定的控制。
3. 过度空腹：一般血液生化检验要求病人晚餐后禁食，至次日晨采血，空腹约8-12h。
但过度空腹，某些检验会有异常结果。
例如血清胆红素可因空腹48h而增加240%；血糖可因空腹过长而减少为低血糖；血脂空腹过度，甘油三酯、游离脂肪酸反有增加，故空腹并非越长越好。
4. 饮酒：饮酒后使血浆乳酸、尿酸盐增加。
长期饮酒者高密度脂蛋白胆固醇偏高，平均红细胞体积增加，甚至可以将这项作为嗜酒者的筛选检查。
5. 吸烟：瘾烟者血液一氧化碳血红蛋白含量可达8%，而不吸烟者含量在1%以下。
血液学方面亦有变化，白细胞数增加，嗜酸粒细胞减少，中性粒细胞及单核细胞增多，血红蛋白偏高，平均红细胞体积偏高。
6. 药物：药物对检验的影响非常复杂，15000多种药物对检验有干扰作用。
众所周知，抗生素、磺胺类药物，对肝功能有大小不一的影响，甚至几片常用药物可以引起严重的药物反应，故在采样检查之前，暂停各种药物是为上策，如不可停用，则应了解可能对检验结果产生的影响。
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5．重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液 0.5ml 和对氨基苯磺酸溶液 20ml，混匀即成。 6．5.g/L 叠氮钠溶液
7．胆红素标准液
3
1
1 目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常 用人混合血清，对此血清的要求如下：
收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。取过滤后 的血清 1ml，加入新鲜 0.154mmol/L NaCl 溶液 24ml，混合。在 414nm 波长，1cm 光径，以 0.154mmol/L NaCl 溶液调零点，其吸光度应小于 0.100；在 460nm 的吸光度应小于 0.04。
实验十六 血清胆红素测定 （改良 J-G 法）
【目的】 1. 熟悉血清胆红素测定的原理和方法； ２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。 【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加 速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆 红素。醋酸钠缓冲液保持反应的 pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂， 最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳 定的蓝色偶氮胆红素，在 600nm 波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
0.8
0.4
-
相当于胆红素浓度（μ
0
34.2 68.4
103
137
171
mol/L）
混匀（不可产生气泡），按总胆红素测定法操作。每一浓度做 3 个平行管，用对照管 调零，读取各管吸光度，以各浓度吸光度均值为纵坐标，以相应的胆红素浓度为横坐标 ， 绘制标准曲线。
【正常参考范围】 血清总胆红素 5.1～17.1μmol/L 血清结合胆红素（1 分钟） 0～6μmol/L 【临床意义】 血清总胆红素测定可判断有无黄疸及反映黄疸的程度。总胆红素在 17.1～34.2μ mol/L 时为隐性黄疸；超过 34.2μmol/L 时，肉眼可见、皮肤、粘膜、巩膜黄染，称显性
【器材】 试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。 【试剂】 1. 咖啡因试剂 称取无水水醋酸钠 41.0g，苯甲酸钠 38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶 于约 500ml 去离子水中，再加入咖啡因 25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解） ， 用去离子水补足至 1L，混匀。过滤后置棕色瓶，室温保存。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2 配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在 25℃条件下， 光径 1.000±0.001cm，波长 453nm，摩尔吸光系数应在 60700±1600 范围内；改良J-G 法 偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在 74380±866。
3 胆红素标准贮存液（171μmol/L）： 准确称取符合要求的胆红素 10mg，加入二甲亚砜 1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。 加入 0.05mol/L 碳酸钠溶液 2ml，使胆红素完全溶解后，移入 100ml 容量瓶中，以稀释用 血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入 0.1mol/L 盐酸 2ml，边加边摇（勿用力摇动，以免 产生气泡）。最后以稀释血请加至刻度。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹， 置 4℃冰箱 3 天内有效，但要求配后尽快作校正曲线。
【操作】
取试管 3 支，按下表操作：
表 3-20 改良 J-G 法测定血清胆红素
加人物(m1)
总胆红素管
结合胆红素管
血清
0.2
0.2
咖啡因苯甲酸钠试剂
1.6
-
对氨基苯磺酸
-
-
重氮试剂
0.4
0.4
混匀，准确 1 分钟
叠氮钠
-
0.05
咖啡因苯甲酸钠试剂
-
1.55
室温 10 分钟
碱性酒石酸钠
1.2
1.2
空白管 0.2 1.6 0.4 -
2. 碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠 75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至 1L，混匀。置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L 亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠 0.5g，用去离子水溶解并定容至 100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存， 稳定期不少于 2 周。若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
黄疸。 血清总胆红素和结合胆红素同时测定，其百分比可用于鉴别黄疸类型。溶血性黄疸时
， 血清总胆红素升高，以为结合胆红素升高为主，结合胆红素占总胆红素的 20%以下；肝 细 胞黄疸时，结合胆红素占总胆红素的 35%以上；阻塞性黄疸时，结合胆红素升高更明显 ， 占总胆红素的 50%以上。
再生障碍性贫血及数种继发性贫血（主要由癌或慢性肾炎引起），血清总胆红素减少。 【结果及分析】 【思考题】 1. 简述血清胆红素测定的原理。 2. 血清胆红素测定中破坏氢键的组分是什么？ 3. 肝细胞性黄疸时，血清中何种胆红素升高？
-
1.2
混匀，600nm 波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。从标准曲线上查出相应的 胆红素浓度。
【标准曲线制作】
2
取试管 6 支，编号，按下表操作：
表 3-21 胆红素标准曲线的绘制
加人物(m1)
对照管
1
2
3
4
5
胆红素标准贮存液
－
0.4 0.8
1.2
1.6
2.0
稀释用血清
2.0
1.6 1.2