人脑少突胶质细胞的培养与鉴定
人脑胶质瘤干细胞的分离培养和超微结构观察的开题报告
人脑胶质瘤干细胞的分离培养和超微结构观察的开题报告一、研究背景人脑胶质瘤是一种具有高度恶性转移、快速生长和易复发的肿瘤。
其发病机制尚不完全清楚，但研究表明，肿瘤干细胞的存在是导致胶质瘤难治性和复发的重要原因之一。
因此，深入研究人脑胶质瘤干细胞的特性和生物学行为，有助于提高该类型肿瘤的治疗效果。
二、研究目的本研究旨在通过分离培养人脑胶质瘤干细胞并观察其超微结构，探究其生物学特性和治疗上的相关机制。
三、研究内容和方法1.分离和培养人脑胶质瘤干细胞通过手术获取人脑胶质瘤组织标本后，对其进行细胞分离和培养。
使用磁珠法或筛选法等方法分离出富含干细胞的细胞群，并进行单克隆形成的培养。
通过免疫细胞化学和分子生物学等技术鉴定识别干细胞的表型和分子标志物表达。
2.观察干细胞超微结构使用透射电镜、扫描电镜等技术，观察干细胞的超微结构和形态特征。
对干细胞的细胞器、核膜、质粒和核仁等细胞结构进行详细观察和描述，并与正常细胞对比分析。
四、论文提纲1. 前言1.1 研究背景及意义1.2 国内外研究现状1.3 研究目的2. 材料与方法2.1 脑胶质瘤组织标本获取方法2.2 细胞分离方法2.3 细胞培养和传代方法2.4 细胞表型和分子标志物的鉴定方法2.5 超微结构观察方法3. 结果3.1 细胞分离和培养结果3.2 干细胞表型和分子标志物的鉴定结果3.3 干细胞超微结构的观察结果4. 讨论4.1 干细胞的生物学特性和治疗上的相关机制4.2 干细胞超微结构观察的意义和启示5. 结论6. 参考文献7. 附录7.1 光镜下胶质瘤组织切片7.2 透射电镜照片7.3 扫描电镜照片光镜下胶质瘤组织切片和透射电镜、扫描电镜照片将作为本研究的附录。
少突胶质细胞荧光标记
少突胶质细胞荧光标记一、引言少突胶质细胞（oligodendrocyte）是中枢神经系统中的一类重要细胞，它们主要负责包围和保护神经元的轴突，形成髓鞘，以增强神经冲动传递的速度。
为了研究和了解少突胶质细胞的功能和分布情况，研究者需要对其进行荧光标记。
本文将探讨少突胶质细胞荧光标记的方法和应用。
二、少突胶质细胞荧光标记的方法2.1 免疫荧光染色法免疫荧光染色法是常用的少突胶质细胞荧光标记方法之一。
该方法利用特异性抗体与目标少突胶质细胞的抗原相互作用，再通过荧光二抗对抗体进行染色，最后使用荧光显微镜观察。
2.2 基因编辑技术基因编辑技术如CRISPR等近年来的重要进展，为少突胶质细胞的荧光标记提供了新的选择。
通过基因编辑技术，研究者可以在少突胶质细胞的基因组中插入荧光标签基因，使得细胞表达荧光蛋白，实现荧光标记。
三、少突胶质细胞荧光标记的应用3.1 观察少突胶质细胞的形态和分布利用少突胶质细胞荧光标记技术，研究者可以观察少突胶质细胞的形态和分布情况。
通过荧光显微镜的观察，可以清晰地看到少突胶质细胞的分支和髓鞘形成情况，从而更好地了解其在神经系统中的功能和分布特点。
3.2 研究少突胶质细胞的发育过程少突胶质细胞的发育过程是神经发育中的重要环节。
荧光标记技术可以帮助研究者观察和追踪少突胶质细胞在不同发育阶段的变化，从而深入了解少突胶质细胞的形成和发育机制。
3.3 评估神经系统疾病中的少突胶质细胞变化少突胶质细胞在多种神经系统疾病的发生和发展中起到重要作用。
通过少突胶质细胞的荧光标记，可以准确评估神经系统疾病中少突胶质细胞的变化，为疾病的诊断和治疗提供依据。
四、少突胶质细胞荧光标记的优缺点4.1 优点•高效：少突胶质细胞荧光标记技术能够高效地标记目标细胞，提高研究者对其的观察和分析效率。
•高分辨率：荧光标记技术可以在细胞水平上观察和分析少突胶质细胞的形态和变化，提供高分辨率的信息。
•非侵入性：少突胶质细胞荧光标记不需要对细胞进行特殊处理，不会破坏细胞的结构和功能。
神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途
神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途神经干细胞是具有自我更新和分化成多种细胞类型能力的多能干细胞。
神经干细胞分化为少突胶质细胞是近年来研究的热点之一。
少突胶质细胞是一种类似于星形细胞的神经胶质细胞，在神经系统中起着很重要的支持作用。
在临床应用方面，少突胶质细胞的作用同样非常重要。
在这篇文章中，我们将会讨论神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及其用途。
神经干细胞分化主要分为两种方法：自然分化和向导分化。
自然分化是指在无添加外源性因素的情况下，神经干细胞随机分化为不同种类细胞。
而向导分化是指在添加一定的外源性因素的帮助下，神经干细胞有选择性地分化为特定种类的细胞。
目前，神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法主要采用向导分化方法。
向导分化方法主要包括以下几种方式：1.小分子化合物诱导小分子化合物是一种可以促进神经干细胞分化的化学物质，通过添加小分子化合物，可以促进神经干细胞向少突胶质细胞的分化。
例如，添加化合物可溶性文件夹（SB431542）可以促进神经干细胞向少突胶质细胞的分化。
2.神经营养因子诱导3.基质分子诱导4.遗传学方法遗传学方法通常采用基因转染的方式，通过转染一些特定的DNA/RNA到神经干细胞中，可以促进其向少突胶质细胞分化。
例如，转染SOX9和PAX6基因可以使神经干细胞向少突胶质细胞分化。
神经干细胞分化需要一种特殊的培养基，称为神经分化培养基。
神经分化培养基的成分复杂，包括不同种类的营养物质、生长因子和基质分子。
不同的培养基成分会影响分化的种类和分化效率。
目前，常用的神经分化培养基包括：1. DMEM/F12：Dulbecco的最小必需培养基/12号哈弗地球村培养基2. 人血清/胎儿牛血清/N2/B27补充因子：这些成分可以为细胞提供必需的蛋白质和营养物质3. 滑膜糖蛋白（CSPG）：CSPG可以促进神经分化4. 神经营养因子（NT-3和BDNF）：NT-3和BDNF可以促进神经分化5.基底板（FN）和羟乙基甲基丙烯酸（HEMA）：这些基质分子可以为细胞提供粘附环境，从而促进神经分化。
体外少突胶质细胞培养的新方法
体外少突胶质细胞培养的新方法翁超;丁曼;樊尚华;董红娟;卢祖能【摘要】目的探讨小鼠鼠婴大脑皮质体外少突胶质细胞培养的新方法.方法取C57/BL6新生小鼠P0～P2(出生后0～2天)的大脑皮质,accummax室温消化10min,然后用含10％ FBS的DMEM/F-12高糖培养基体外培养,培养至第7天时,运用巴氏管吹打,从混合培养的细胞中分离纯化少突胶质前体细胞,然后加入促分化培养基促使少突胶质前体细胞分化发育成熟,行细胞免疫荧光进行鉴定.结果少突胶质前体细胞纯度较高,达到93.3％左右.加入促分化培养基后,少突胶质前体细胞可快速分化发育成熟.结论该体外少突胶质细胞培养方法较简单,细胞纯度及产量高,对临床脱髓鞘疾病的研究具有很大的应用价值.%Objective To explore a new method for oligodendrocyte cell culture from neonatal mouse cerebral cortex in vitro.Methods We selected P0-P2 (0-2 days after birth) cerebral cortex from C57/BL6 neonatal mice,and digested the tissue at room temperature for 10 minutes through accummax,then used DMEM/F-12 medium with high glucose containing 10％ FBS to culture the mixed cells in vitro.After the celles being cultured for 7 days,we used pap tube for pipetting,and purified oligodendrocyte precursor cell (OPCs) from mixed cultured cells.Finally,with oligodendrocyte differentiation medium to promote oligodendrocyte differentiation and maturation,cell lines were identified by immunofluorescence.Results Our approach produced a high yield of purified OPCs,which was about 93.3％.The oligodendrocyte differentiation medium promoted oligodendrocyte differentiation and maturation quickly,when it was added.Conclusion The new method foroligodendrocyte cell culture in vitro is relatively simple with high purity and can produce a high yield of OPCs,which is of great value for clinical demyelinated diseases.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2017(046)004【总页数】4页(P48-51)【关键词】少突胶质细胞前体细胞;纯化;增殖;分化【作者】翁超;丁曼;樊尚华;董红娟;卢祖能【作者单位】430060 武汉大学人民医院神经内科;430060 武汉大学人民医院神经内科;430060 武汉大学人民医院神经内科;430060 武汉大学人民医院神经内科;430060 武汉大学人民医院神经内科【正文语种】中文【中图分类】R74;R3少突胶质细胞(oligodendrocyte, OL)是中枢神经系统(central nervous system, CNS)髓鞘形成细胞。
少突胶质细胞的分离培养方法
四、实验步骤 (1) 取出高压灭毒物品,置于超净台中。 (2) 在冰板上放置玻璃培养皿,皿中均加入适量解剖液,预 留最后一套小培养皿不加。 (3) 用 75% 酒精泡上钟表镊。 (4) 配制 3ml0. 125% 胰蛋白酶:1. 5mL 0. 25% 胰蛋白酶; 300μL 0. 1% DNA 酶;解剖液稀释至 3 mL。 (5) 取新生 24h 内 SD 大鼠,75% 的酒精消毒头部皮肤,用 眼科剪依次切开皮肤颅骨及硬脑膜,然后取出脑组织放在 PBS 缓冲液中,将取出的脑组织放在解剖显微镜下,用小镊子剥除 软脑膜、脑干、海马及血管组织。 剩余的脑皮质切成 1mm2 的组 织小块,放入盛有 PBS 的 离 心 管 中, 然 后 用 吸 管 轻 轻 反 复 的 吹打。 (6) 用 70μm 筛网过滤,剪碎后在 0. 125% 的胰蛋 白酶 中 37℃ 消化 15min,用含有血清的 DMEM 培养基终止胰酶消化。 轻轻吹打使细胞分散后,离心机 l000 r / min 离心 lOmin,弃去上 清液,加入 10% FCS+DMEM / F12 的培养液重悬离心后的细胞, 细胞以约 106 / cm2 浓度种植在 75cm2 的培养瓶内。 (7) 细胞放入 5% CO2 的培养箱中培养大约 40min,翻转培 养瓶几次后吸出细胞悬液,取出已经贴壁了的贴壁细胞,主要 是成纤维细胞,把细胞的悬液种植在涂有多聚赖氨酸 75cm2 的 培养瓶中,培养瓶内加入 8 至 10ml 的 10% FCS+DMEM / F12 的 培养液。
(8) 有细胞种植的培养瓶静置 3 天,3 天后隔天换液,培养 至第 9 天。
(9)少突胶质细胞的分离与培养:在接种 9 天,细胞达到融 合后,根据少突胶质细胞和星形胶质细胞系黏附特性的差异和 生长时间的不同,本实验采取差速震荡法对少突胶质细胞进行 分离和纯化。 首先在 37℃ 恒温摇床上低速震荡来去除小胶质 细胞(200rpm,1h—2h) ,此处收集小胶质细胞( 收集振摇下来的 细胞悬液,1000xg 在 4℃ 离心 10 min,弃上清,细胞用适量完全 培养液重悬,调整细胞密度,接种于培养皿中,4 h 后收集未贴 壁细胞。 换新鲜培养液继续培养。 原混合胶质细胞培养瓶, PBS 洗涤 2 次,加入新鲜培养液,不换液培养 7 d,按上述方法 再次获得 MG) 更换(10% FCS+DMEM / F12) 培养基,培养 2 ~ 4h 后再放 入 37℃ 培 养 箱。 在 恒 温 摇 床 上 用 高 速 震 荡 法 过 夜 (200rpm. ,18 ~ 20h) ,此时收集的摇下来的细胞用吸管收集种 植在未处理过的培养瓶上,把培养瓶放在 37℃ 的细胞培养箱内 30 至 60min,目的是使混杂在细胞悬液中的星形胶质细胞及小 胶质细胞贴壁,然后把细胞悬液种植在涂有多聚赖氨酸 75cm2 的培养瓶内,培养液为含含有细胞因子的少突胶质细胞的培养 液,采取半量换液法隔天换液,培养 4-5 天,促进 OPCs 分裂增 殖,再次在恒温摇床上用高速震荡法 (180rpm,1h) 分离传代, 进一步使少突胶质细胞纯化。
人少突胶质前体细胞培养
1600Human Oligodendrocyte Precursor Cells人少突胶质前体细胞少突胶质前体细胞是Raff、Miller 和Noble于1993年首次发现，并已进行了深入的研究。
在文献中，前体细胞指少突细胞型星形胶质细胞祖细胞或少突胶质细胞前体细胞。
发育中和成熟的中枢神经系统都含有少突胶质前体细胞。
少突胶质细胞，中枢神经系统中的髓磷脂组成细胞，来源于少突前体细胞。
在培养中，少突前体细胞在基本的成纤维细胞生长因子存在的情况下可产生于神经祖细胞或神经干细胞，OPC在血小板衍生的生长因子或星形胶质细胞产生的生长因子存在的情况下才能增殖，并分化成为成熟的少突胶质细胞。
正因如此，它们为研究发育转型提供了特殊的细胞种群。
细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。
将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。
启封1.对于冰冻细胞：如果包装箱里干冰，并且你不想立即培养细胞，将冻存管立即放入液氮中。
如果包装箱中没有干冰，立即融化培养细胞2.对于增殖的细胞：用70%的酒精喷洒培养容器(瓶，板或slide)以消毒。
将细胞放入37°C，5%二氧化碳培养箱中平衡两小时。
细胞平衡好后，更换新鲜培养基。
经过以下步骤后开始培养细胞1.用层粘连蛋白或多聚赖氨酸包被培养容器少突胶质前体细胞接种在层粘连蛋白或多聚赖氨酸包被的培养瓶中将促进细胞帖壁和神经突生长(多聚赖氨酸包被：浓度为2 μg/ml 包被培养瓶或培养板1小时，然后用无菌水洗三次)，这一点非常重要。
2.培养基的准备：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。
在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。
用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。
3.准备培养：为每一支冻存管准备一个T-75培养瓶。
加入适量的培养基(推荐20 ml/T-75培养瓶)，将培养瓶放入37°C，5%二氧化碳培养箱中至少平衡30分钟4.融化细胞：将小瓶入入37°C水浴中，握住并轻轻的旋转小瓶直到完全融化。
少突胶质前体细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用
少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它的主要功能是产生髓鞘包绕神经轴突，维持神经冲动沿轴突跳跃性传导；另外它还分泌多种神经营养因子，支持神经元的生长与存活[1]。
少突胶质前体细胞（oligodendrocyte pre-cursor cells，OPCs）是处于分化早期阶段的未成熟细胞，具有良好的增殖能力，能在体内增殖、迁移，最后分化为成熟少突胶质细胞并为髓鞘形成发挥重要作用。
高纯度OPCs 的制备、培养是一切研究工作的基础，目前，国内外对大鼠OPCs的培养报道很多，有关小鼠OPCs的培养方法及研究报道还比较少，本文参照国内外文献报道的新生大鼠OPCs的培养方法[2-3]，探索小鼠OPCs的培养及鉴定，并研究重组巨噬细胞移动抑制因子（rMIF）对其增殖活性的影响，为进一步深入研究其发育、分化以及移植治疗脊髓损伤等奠定基础。
少突胶质前体细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用研究段朝霞1，2张洁元1，2陈魁君1，2王建民1、2李兵仓1，21.创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室，重庆400042；2.第三军医大学野战外科研究所六室，重庆400042[摘要]目的少突胶质细胞是中枢神经系统的重要组成部分。
本文探讨获取小鼠高纯度少突胶质前体细胞系的培养及鉴定方法，以及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对其增殖活性的调节。
方法取新生（0~2d）C57B6小鼠的大脑皮层进行混合胶质细胞培养，在9~10d时采用振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，然后用添加了神经营养因子（N2）、血小板衍生生长因子-AA（PDGF-AA）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清培养基培养。
倒置显微镜下每天观察细胞的生长情况，免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定。
然后按104个细胞/孔加入96孔板培养，细胞70%~80%融合时用不同浓度MIF处理细胞，48h后用甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖程度。
结果获得纯度90%以上少突胶质前体细胞（OPCs），少突胶质前体细胞NG2及血小板衍生生长因子受体（PDGFR）抗体阳性；胶质细丝酸性蛋白（GFAP）及髓鞘碱性蛋白（MBP）均为阴性。
人胚脑组织干细胞的分离、培养与鉴定
人胚脑组织干细胞的分离、培养与鉴定神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，终于产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
采纳无血清培养和单细胞克隆法可从人胚脑皮层中分别得到具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，并采纳免疫荧光染色对其举行鉴定。
【材料】 1．组织来源胚龄10周自然流产的人胚胎。
2．培养用试剂（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。
(2）消化液：0.25%和0.02% EDTA混合消化液。
3．培养基配方和制备（1)人胚脑组织干细胞培养液：DMEM/F12 (1：1)无血清培养基，含有2% B27,20ng/ml表皮细胞生长因子（epidermalgrowth factor, EGF) ,20ng/ml bFGF。
(2）人胚脑组织干细胞诱导培养液：添加20％的DMEM/Fl2 (1：1)。
4．试验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管、手术刀片。
【办法】 1．取材无菌条件下分别出胚胎大脑皮质组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次。
在含有DMEM/F12的培养液中，用眼科剪将其充分剪碎。
2．消化用0.25%和0.02% EDTA混合消化液消化细胞团5分钟，吸管将细胞团打散，加入含10% FBS的培养液终止反应。
3．分别细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。
用巴斯德吸管反复吹打组织碎块至彻低散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液。
4．接种与培养细胞计数，将细胞以2x106/ml密度接种至培养板上。
置37℃,5% C02饱和湿度的孵箱中培养。
直至NSCs增殖形成神经球后再换液。
首次传代后每3天半量换液。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
oligodendroglial cel l cu ltures from rat cerebral t issu e[ J] . J Cell B-i
o,l 1980, 85 ( 3) : 890 - 902.
[ 4] K oper JW, Lopes-Cardozo M, R om ijn H J, e t al. C ulture of rat cere-
59 6
军事医学科学院院刊 2005年 6月 第 29卷 第 3期
3 讨论
我们获得了少 突胶 质细胞, 并 在体 外长期 传代 培养, 仍 能维持正常的细胞形 态。在细 胞培养过程中 发现, 在培养初 期, 可见有多种细胞存在, 有神 经元、星 形胶质细胞 和少突胶 质细胞等。神经元在体外培养 存活时间短, 星形胶 质细胞贴 壁快, 1~ 2 h, 且黏 附力 强, 而少 突胶 质细 胞贴 壁周 期长, 贴 壁不牢。根据细胞的不同生长 特性, 在 分离初期去 除贴壁的 细胞, 在传代的过程中, 弃去贴 壁牢的细胞, 从而获 得少突胶 质细胞。通过细胞形态、细胞超微结构 观察以及免 疫组化检 测表明, 该细胞为 少突 胶质细 胞。综上 所述, 我们 从脑 组织 中成功地分离到 较纯的 少突 胶质细 胞, 并长 期传代 培养, 该 工作为进一步研究打 下了基础。 [ 关键词 ] 少突神经胶质; 细胞, 培养的; 免疫组化 [ 中图分类号 ] Q 813111 [文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 1000-5501( 2005) 06-0595-02
染色体数目为 46 条, 包括一 对性 染色体。 细胞 染色体 数目正常 (图 5), 表明该细胞染色体未发生畸变。
[收稿日期 ] 2005- 01- 05 [基金项目 ] 国家 / 9730 课题 ( 2001CB509906 ) ; 国 家 / 8630课
题 ( 2002AA 205051, 2003AA 205160) [作者简介 ] 陈 琳 ( 1964- ), 女, 四川省合江县人, 高级实验师。 * 通讯联系人, E-ma i:l peixt@ n ic. bm .i ac. cn
d rogl ial p rogen itors from neu ral stem cells [ J] . J N eu rocyto,l 1998,
27( 7) : 475- 489.
(本文编辑 孙承媛 )
***
# 读者 # 作者 # 编者 #
外国人名的正确书写
在我们编辑稿件 时, 发现不少作者在参考文献中著 录英、美人 的姓名时 常常发 生错误, 现 将常见 的几种错 误及正 确的著 录格式列出, 供参考。①不了解英、美人 名前姓后的习惯, 把第一个名字 当作姓, 而把姓当 作名并且 缩写, 如 将 Steven A. L eadon, 写成 Steven AL, 正确的 著录应该是 L eadon SA。②把教名当作姓, 而把真正的姓完全舍弃不写, 如将 John E. B iag low 错误地 著录为 John E, 正确的著 录应该是 B iag low JE。③把表示父子间晚辈的缩写词 Jr. , 以及 表示几代人晚辈的Ⅲ等不正确地省略, 如将 Ear l F. W a lbo rg Jr. 著录为 W a lborg EF, 正确的写法应该是 W a lbo rg EF Jr. 。
S-100蛋白主要存在于胶 质细胞 中, 特 别是 星形 胶质细 胞和少突胶质细胞。而胶质酸性蛋白 ( G FAP )是星形胶质细 胞的特异性标志蛋白。 采用免疫 组化 检测, S-100抗 体染色 为阳性, 胞浆染色 (图 3), 少突 胶质 细胞特 异性 表达 标志神 经节苷脂 ( GC )抗体 染色为 阳性, 胞核染 色 ( 图 4), GFAP 抗 体不染色, 表明分离培养 的细胞为少突胶质细胞。 2. 4 染色体检查
2 结果
2. 1 细胞形态观察 分离培养的胚胎脑细 胞胞体 为圆 形、椭 圆型 或多角 形,
细胞伸出细长突起。核呈圆形或椭圆形 (图 1)。
图 1 少突胶质细胞形态 ( @ 48 )
2. 2 透射电镜观察 细胞浆电子密度高, 有较多 的核 糖体和 粗面 内质网, 线
粒体不规则, 内有许多管 嵴。胞核 内有较粗大的异染色质块 (图 2)。 2. 3 免疫组化检测
洋, 王韫芳, 闫
舫, 南
雪, 谢小燕,
少突胶质细胞是中枢神经 的成髓鞘神经胶质细胞, 它包 绕神经纤维的轴突形成髓鞘, 对轴突正常的电传导功能 有重 要作用 [ 1] 。将少突胶质细 胞移植 入髓鞘 形成障 碍或脱 髓鞘 的中枢神经系统内, 可揭示髓鞘形成和再生机制 [ 2] 。由于体 外培养的少突胶质细 胞与其在体内的特性相关 [ 3] , 因此通过 体外培养研究可了 解少突 胶质细胞 的存活、增 殖、分化和 发 育过程中的细胞生 物学变 化。然而中 枢神经 系统 具有细 胞 多样性, 它包括神经元、星形胶 质细胞、少突胶质细胞和 小胶 质细胞, 所以必须对少突胶质细胞进行体外纯化。目前 纯化 的方 法很多, 如密度梯 度法 [ 4] 、神 经干细胞 定向诱导分 化培 养法 [ 5] 等。前者得到的 细胞纯度 低, 后者操 作繁琐, 条件 要 求高。我们采用含 20% 胎牛 血清 的低 糖 DM EM 体 外培养, 同时根据少突胶质细 胞与星 形胶质 细胞培 养层黏 附特性 不 同进行分离培养, 获得了少突胶质细胞。
1 材料和方法
1. 1 材料 脑组织取自水囊 引产 6个月龄人胚 。低糖 Eag le DM EM
购于 G ibco公司。秋水 仙 碱、抗人 GC 单 抗为 Sigm a 公司 产 品。胰酶为 Am resco公 司产品 。胎牛 血清 由浙 江杭 州四 季 青生物工程 材料 研究所 生产。抗 人 S-100 多抗、抗 人 G FAP 多抗均购于中山生物 技术有限公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 细胞分 离培养 将水 囊引 产的 胚胎 浸于 75% 乙 醇 中消毒 5 m in, 无菌状态下取脑组织, 生理盐水 洗涤 1 ~ 2次, 去除脑膜和 血管 纤维。在 PBS 中吹 打成 细胞 悬液, 于离 心 管中室温放置 5~ 10 m in, 去除上层脂肪, 重复操作 1次。向 细胞中加入 PBS, 过 100目筛网, 去除组织团块。 1 200 r/m in 离心 5 m in, 弃 上清。加入 DM EM 完全培 养液, 按 1 @ 106个 细胞 /m l接种于 T-25 的培 养瓶 中。 37e , 5% CO2培 养箱 中 静置培养 3~ 4 h, 吸 取上层 未贴壁 细胞转移 至新培 养瓶中, 继续 培养, 培 养体系 为含 20% 胎 牛血 清的低 糖 DM EM。每 3~ 5 d换 1次液, 当 细胞 铺满 瓶 底 14 ~ 20 d时 , 用 0. 02% EDTA - 0. 25% 胰酶消化传代。 1. 2. 2 细胞生物学分析 1. 2. 2. 1 细胞形态观察 用倒置显微镜观 察。 1. 2. 2. 2 超微结构检测 用透射电镜观察 。 1. 2. 2. 3 免疫组化 鉴定 细胞爬 片, 用 4% 多聚 甲醛室 温 固定 15 m in, PBS洗涤 2次。用含 0. 1% T ritonX-100的 0. 3% H2O 2-甲醇溶液室温孵育 10 m in, 蒸馏水 洗, PBS浸泡 5 m in。 10% 山羊血清工作液室温孵育 15 m in, 去血清。加 抗体, 4e 过夜, PBS洗涤。加生物素标记的二抗, 37e , 15 m in, PBS洗 涤。加辣根过氧化物酶标 记的抗 生物素抗 体, 37e , 15 m in,
b ral ol igodendrocytes in a serum - free, chem ically def ined m ed ium
[ J]. J N eu rosci M ethods, 1984, 10( 2) : 157- 169.
[ 5 ] Zhang SC, Lundb erg C, Lip sitz D, e t a l. G enerat ion of oligoden-
PBS洗涤。 DA B底物显色, 自来水洗。 1. 2. 2. 4 染色体检查 向指数生长期的单层细胞 培养液中 加入秋水仙碱 至终 浓 度为 0. 03 L g /m ,l 37e 继 续 培养 4 ~ 6 h。用吸 管 轻 轻 吹 打 细 胞 使 其 脱 落, 1 000 r/m in 离 心 5 m in, 收集 分裂 相细胞。 加入 0. 075 m o l/L K C l溶 液, 37e 温浴 30 m in, 离心, 收集细胞。将甲醇与冰醋酸混合液 ( 3B1) 加到细胞中, 混匀, 37e 固定 15~ 20 m in, 重 复固定 3次。制 片, G iem sa染色, 自然干燥。光学显微镜观察、计数, 分析。
军事医学科学院院刊 2005年 12月 第 M ed S c,i D ec 2005; V ol 29 N o 6
5 95
人脑少突胶质细胞的培养与鉴定
研究简报
陈 琳, 白慈贤, 张 锐, 李艳华, 高艳红, 王冬梅, 吕 施双双, 裴雪涛*
( 军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
[参考文献 ]
[ 1] 陈宜张. 分子神 经生物 学 [ M ]. 北京: 人民 军医出 版社, 1995.
247- 266.
[ 2 ] 何 平, 沈馨亚. 少突胶质细胞增殖和分化的研究进展 [ J] . 神 经解剖学杂志, 2000, 16 ( 2) : 183 - 188.
[ 3] M cCarthy KD, de V ellis J. Preparation of separate astroglial and