超氧化物歧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶活性测定方法的比较
超氧化物歧化酶活性测定方法的比较超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）是一种具有抗氧化作用的酶，可以有效抵抗自由基的氧化损伤。
SOD参与氧化还原反应，将超氧化物分子分解为氧化物和水。
SOD的活性可以用不同的测定方法来测定，主要有O-苯肼试剂盒法、異氰酸酯鹽试剂盒法、氢还原酶和邻苯二甲酸脂肪酸试剂盒法。
本文将对各种SOD活性测定方法进行比较，包括它们的特点、优缺点以及应用领域。
O-苯肼试剂盒法是SOD活性测定最常用的方法之一，主要方法是利用O苯肼试剂盒结合H2O2反应，形成一定比例的黄色褐色混合物，以此来测定SOD活性。
这种方法使用简单，耗材低廉，检测结果准确可靠，测试步骤速度快，但是受金属离子的干扰，反应缓慢，受光机理的影响，本检测方法仅限于室内应用，无法应用于室外场合。
異氰酸酯鹽试剂盒法是另一种常用的SOD活性测定方法，也是最常用的能量尺寸之一。
它主要是利用氧分子由異氰酸酯鹽发生氧自由基，游离基团发生还原，在可见光范围内反应形成一定量黄色溶液，通过比较溶液的黄色光谱强度以及反应完成时间差来测定SOD活性。
異氰酸酯鹽试剂盒法的优点是实验操作简单，可以在室外环境下进行，但缺点是检测结果容易受环境温度、湿度和光照等外界因素的干扰而受影响。
氢还原酶试剂盒法是一种新型、简便并具有较高灵敏度的方法，它可以利用氢还原酶将O2-还原为H2O2，并由H2O2生成一定比例的紫色胆红，以此来测定颗粒氧。
它可以快速测定氧分子，不受有毒物质的影响，结果准确可靠，但它的缺点是受环境温度、湿度、光照等外界因素的影响较大、速度较慢。
最后，邻苯二甲酸脂肪酸试剂盒法也是一种常用的SOD活性测定方法，它采用一定量的脂肪酸酯和可溶于水的邻苯二甲酰亚胺溶液配制成邻苯酸酯试剂，将SOD和溶液发生反应，形成一定量的邻苯二甲酸酯，用吸光法测定所得的邻苯酸酯溶液的吸光密度值，以此来衡量SOD活性。
它的优点是测试结果准确可靠，抗干扰能力强，实验操作简便，可定性可定量地测定SOD活性。
4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片。
（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支，黑色硬纸套。
（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS缓冲液（pH7.8）：7.1g/L ，6.8g/LKH2PO4，按体积9:1混合，如pH高或低于7.8，则用KH2PO4或Na2HPO4调节。
每1000mL缓冲液含8gNaCl，0.2gKCl] 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。
（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存，现用现配。
超氧化物歧化酶的活性测定
超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
超氧化物歧化酶活性的测定
植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法【实验目的】1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。
2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。
【实验原理】超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。
SOD 是含金属辅基的酶。
高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。
SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。
超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。
生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ：2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。
本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。
有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。
被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。
当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。
当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。
于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。
抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。
常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。
【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管2. 实验试剂50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液； 100μmol/L EDTA- Na 2溶液；CATSOD20μmol/L 核黄素溶液；SOD 提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1% PVP 。
氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力
氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力一、 目的与要求SOD 在植物抗逆过程中发挥着重要的作用，通过本实验理解其抗逆机理，熟悉其操作步骤及其计算方法。
二、原理SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。
而SOD 可清除O 2-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活力单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。
222222SOD O H H O O -+−−−→+222222CAT H O H O O −−−→+三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx ）；5.试管（三）试剂：1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na 2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH 2P048.5 ml ）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9397gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml ；3. 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存；4. 100μmol/L EDTA －Na 2溶液：称取0.03721gEDTA －Na 2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。
四、实验步骤1. 酶液提取：取叶片0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 预冷的PH 7.8的磷酸缓冲液，在研钵上研磨成匀浆，加缓冲液使终体积为10ml ，取5ml 于4度下4000rpm 离心15min ，上清液即为SOD 粗提液。
超氧化物歧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。
因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。
超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。
步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。
2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。
3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。
4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。
5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。
6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。
7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。
超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。
1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
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植物生理学模块实验指导
李玲主编
科学出版社
超氧化物歧化酶的测定方法
【实验目的】
学习测定超氧化物歧化酶活性的方法。
【实验原理】
超氧化物歧化酶（SOD）普遍存在于动植物与微生物体内。
SOD是含金属辅基的酶。
高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。
SOD能够清除超氧阴离子自由基（O2—·），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。
超氧阴离子自由基（O2—·）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。
超氧化物歧化酶催化以下反应：
2 O2—·+ 2H+ ═H2O2+O2
超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD活性。
本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。
有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。
被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2—·。
当加入NBT 后，在光照条件下O2—·又可将NBT还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。
当加入SOD时，SOD可通过清除O2—·，而抑制NBT的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。
于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。
抑制NBT光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。
常常将抑制50%的NBT光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U）。
【器材与试剂】
1.实验仪器与用具
研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、微量移液枪、离心管、光照箱（光照度为4000lx）、指形玻璃管、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）
2.实验试剂
0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。
酶提取缓冲液：称取77mg DTT、5g PVP，加入0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8），定容至100ml，摇匀，即得提取缓冲液（含5mmol/L DTT和5% PVP），低温（4℃）贮藏备用。
50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。
130mmol/L L-蛋氨酸（MET）溶液：称取 1.94g L-蛋氨酸，用50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）溶解，定容至100ml，充分混合（现用现配）。
低温避光保存，可使用2~3d。
750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.3mg NBT，用蒸馏水溶解，定容至100ml，充分混匀（现用现配）。
低温避光保存，可使用2~3d。
100μmol/L Na2-EDTA溶液：称取37.2mg Na2-EDTA，用蒸馏水溶解，定容至100ml，使用时稀释100倍。
低温避光保存，可使用8~10d。
20μmol/L 核黄素溶液：称取75.3g核黄素，用蒸馏水溶解，定容至100ml，使用时稀释100倍。
低温避光保存，即用黑纸将装用该液的棕色瓶包好，现用现配。
3.实验材料
经逆境处理的绿豆幼苗、芹菜或茶叶
【实验步骤】
1.酶液制备
取材，称取5g样品，置于研钵中，加入5ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。
将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、12000g离心30min，收集上清液，低温保存备用，测量提取液总体积。
2.活性测定
用5支玻璃管进行测定。
按照表1所列内容加入各种溶液（注意最后加入核黄素溶液）。
其中3支为测定管，2支对照管。
混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应下反应15min后，立即置于暗处终止反应。
以避光管作为空白参比调零，分别测定560nm处其他各管的吸光度。
表1 测定SOD活性时各试剂加入量
试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8） 1.7
130mmol/L L-蛋氨酸（MET）溶液0.3 13mmol/L
750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液0.3 75μmol/L 100μmol/L Na2-EDTA溶液0.3 10μmol/L
20μmol/L 核黄素溶液0.3 2.0μmol/L
酶液0.1 对照2支试管以缓冲液代替
总体积 3.0
【实验报告】
1.测定数据记录
重复次数样品
质量
m/g
提取液
体积
V/ml
吸取样
品液体
Vs/ml
560nm吸光度样品中SOD活性/U
ODc ODs 计算值平均值±标准偏差
1
2
3
2.计算
显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ODs）和照光对照管反应混合液的吸光度（ODc）。
以每分钟每克植物组织（鲜重）的反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%为一个SOD活性单位（U）表示。
SOD=
式中，ODc为照光对照管反应液的吸光度；ODs为样品管反应混合液的吸光度；V为样品提取液总体（ml）；Vs为测定时所取样品提取液体积（ml）；t为光照反应时间（min）；m为样品质量（g）。
也可以每分钟反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个SOD活性单位（U）。
【注意事项】
1.通过预实验，摸索显色反应所需的时间；
2. 当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶液和核黄素除外）按比例混合后一次就加入2.6ml，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变，其余各步骤与上相同。
3. 要求各管受光情况一致，所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。
反应温度控制在25℃，视酶活性高低适当调整反应时间。
温度较高时，光照时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。
4. 所用指形管要结晶透明，透光性好。
用浅底广口的小玻璃皿照光效果更好。
5. 线粒体内SOD酶浓度较高，因此研磨要充分。
【思考题】
1.在SOD测定中为什么设照光和不找光两个对照管？
2.影响本实验准确性的主要因素是什么？应该如何克服？。