用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告
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用正交法测定几种因素对酶活力的影响
一、前言
正交实验法
正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析,实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件,以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样,使每次试验都具有较强的代表性,由于正交表具备均衡分散的特点,保证了全面实验的某些要求,这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。正交实验设计包括两部分内容:第一,是怎样安排实验;第二,是怎样分析实验结果。
酶活力
酶活力(enzyme activity )也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中,底物往往是过量的,测定初速度时,底物减少量占总量的极少部分,不易准确检测,而产物则是从无到有,只要测定方法灵敏,就可准确测定。
二、实验目的
1•学习并掌握正交法应用原理。
2. 采用正交法测定多种因素对酶活力的影响。
三、实验原理
酶促反应常常同时受到多种因素(包括激活剂和抑制剂等)的交互影响,可采用正交法进行综合研究,即通过少量试验收到更好的效果:多快好省。本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin活性的影响,以求得酶活最大时相应影响因素的最佳值
(水
平),并借此初步掌握正交法的使用
四、实验器材和试剂
实验器材:
①试管
②漏斗
③温度计
实验试剂:
①2%血红蛋白液(Hb)
②15%三氯醋酸液(TCA)
③trypsin酶液④吸管
⑤恒温水浴锅
⑥分光光度计
④0.04mol/L巴比妥缓冲液(pH 7, 8, 9)
⑤考马斯亮蓝染液
五、实验操作
1.实验设计
本实验为四因素三水平(总试验次数34=81),可选用L9正交表
(仅需9次试验),展开后其特性为均衡搭配
(1)每列中水平数1、2、3出现次数相同,均为3次;
(2)每两列的横行数对(1-1/1- 2/…13213-3各出现一次
将各因素及其相应水平参数依次填入得到实验安排表
(1)各试管编号,分别加入对应容量的底物(2% Hb)和相应pH
值的缓冲液,混匀;
(2)同温处理的3支试管同时预温5min ;
(3)各试管依序分别加入对应容量的trypsin酶液(统一加样时间间隔),混匀;
(4)同温处理的3支试管置对应恒温水浴中反应10min ;
(5 )各试管依次加入15%三氯醋酸液2ml,混匀以终止反应;
(6)非酶促对照:另取一试管,先加入2%血红蛋白液0.5ml 及pH8缓冲液2.0ml,再加15%三氯醋酸液2.0ml,混匀静置10min 后再加入酶液0.5ml ;
(7)上述各管反应液室温静置15min后过滤,取滤液待测酶活;
(8 )酶活测定(考马斯亮蓝法,标准曲线制备略):取试管若干支编号,分别加入对应的样品滤液1.0ml及考马斯亮蓝液4.0ml ,混匀,室温静置3min ,以非酶促对照管为空白,于波长595nm比色测定。
3. 数据记录及分析
将各管测定所得光密度值对应填入表格,分别算出各因素一、二
及三水平的试验结果总和I、H和皿,并分别取其平均值计算相应的极差(各列中最大与最小值之差);比较各因素极差的大小以评估各因素对酶活的影响,并对酶活最高时的各因素水平作一直观分析。
六、实验结果及数据处理
1. 实验数据:
II /3
0.3082 0.1337 0.0779 0.0629
皿/3
0.1103 0.0965 0.1229 0.1408
极差
0.2415
0.0787
0.0450
0.0779
由上述表格各因素极差大小可看出,底物浓度对于酶活力影响最
大,其次是酶浓度,再次是pH ,最后是温度。
根据上表数据,以吸光度值(I 1313、皿13 )为纵坐标,因
素的水平数为横坐标作图
从图一可看出,在一定浓度范围内,随着底物浓度的增大,酶活
力是逐渐降低的,约在底物浓度为 0.5mol/ml 时酶活力达到最低。
图一底物浓度对酶活力的影响
从图二可看出,在一定浓度范围内,随着酶浓度升高,酶活力是
逐渐降低的,约在酶浓度为0.55mol/ml时酶活力达到最低。
图三温度对酶活力的影响
从图三可看出,在一定浓度范围内,随着温度升高,反应速率是
逐渐升高的,即酶活力是逐渐升高的,约在温度为50 C时酶活力达
到最
高。
—系列1
0.04
0.02
6 8 10
图四pH对酶活力的影响
从图四可看出,在一定浓度范围内,随着pH升高,反应速率是
逐渐升高的,即酶活力是逐渐升高的,约在pH为8时酶活力达到最
七、实验注意事项
1•每加入一种试剂都需要充分混匀。
2. 应确保酶促反应的温度及反应时间的准确性。
八、思考题
1. 正交法有何优点?
答:通过少数的实验次数找到较好的生产条件,能够在因素变化范围内
均衡抽样,使每次试验都具有较强的代表性,保证了全面实验的某些要求,这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。
2. 各管温育后为何要加入三氯醋酸液?
答:三氯醋酸液可作为蛋白质沉淀剂,使反应停止,进而保证变量的统
一。
3. 非酶促空白对照的作用是什么?其处理为何与其他各管不
同?
答:非酶促空白对照的作用是为了保证实验变量的统一。因为其理论上
讲并不会发生任何反应,因此不需经过加热,剩下其余条件都要和实验组相一
致。