生物化学综合实验报告
存车处
生物化学综合实验实验报告
项目名称：核酸的分离纯化及性质研究
指导教师：商亚芳
班级：食品科学与工程类13-04班
姓名：俞海清
学号：2013218687 日期：2015/07/02-07/03 小组成员：俞海清曾斯棋
核酸的分离纯化及其性质研究
摘要：提取植物组织DNA和动物肝脏的DNA，先要破碎细胞，然后通过离心获得沉淀。分理
出脱氧核糖蛋白（DNP）。利用阴离子除垢剂（SDS），将蛋白质和DNA 分离开来，用氯仿-异戊醇去蛋白质蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，之后用乙醇将DNA沉淀出来，得到粗蛋白质。为了获得高纯度的DNA，采用适量的RNase来降解残留的RNA，再利用乙醇来
提取DNA，重复多次来获得较纯的DNA。再利用DNA紫外吸收特性测定DNA的纯度时，发现提取出来的DNA纯度比较高。利用二苯胺法测定DNA的含量，发现DNA含量偏低。DNA产率很低。最后采用琼脂糖凝胶电泳来分离DNA，测定DNA片段的分子质量。结果实验成功的在紫外线下观察出了标准DNA条带以及待测样品条带。
Abstract: In order to extract the plant’s DNA and the pluck’s DNA.we should break cells,then separate the https://www.360docs.net/doc/542975685.html,e the SDS to break protein and DNA.Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture can make protein denaturation .place it on the centrifugal machine to remove the protein .Then,take let the DNA dip into ethylalcohol.it can separate the DNA .
In order to obtain high purity DNA, use the right amount of RNase to degradate residual RNA, recycled ethanol to extract DNA over and over https://www.360docs.net/doc/542975685.html,ing ultraviolet absorption characteristics determine th
e purity o
f DNA .we found that the purity of DNA is high.Diphenylamine is used to check the content of DNA, the discovery of DNA’s content is low. DNA’s yield is very low.Finally, agarose gel electrophores is used to separate DNA and check molecular weight of DNA fragments.Under the uv light,we found standard DNA bandin
g and the banding whic
h belong to pending text sample successfully.
关键词：DNA 分离二苯胺乙醇琼脂糖凝胶电泳氯仿-异戊烷
Key words：DNA separate diphenylamine
ethylalcohol agarose gel electrophores
Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture
前言：
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。核酸是由许多核苷酸
聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞
微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。无论是进行核酸结构，还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。在核
酸分离提取中最重要的是要防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸的
磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。
实验原理：
1.植物组织中核酸的分离与纯化原理：DNA存在于细胞核中，天然状态的DNA
大多数是以脱氧核糖核蛋白的形式存在，从细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖
（DNP），在将蛋白质除去。阴离子去垢剂SDS可使DNA与蛋白质分离，再用含少量的氯仿去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NACL为例
RNP0.14mol/LNACL中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%；当NACL浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解度则随之增加；当NACL的浓度为1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1mol/LNACL提取DNA。进一步制备高纯度的DNA,可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中掺杂的RNA.为了防止提取过程中DNA被细胞中释放出来的DNase 降解以及DNA变性，整个提取过程应该在低温度下进行，同时可在研磨缓冲液中加柠檬酸三钠和Na2-EDTA抑制DNase的活性。提取的DNA是否为纯净，双链，高分子化合物，一般要通过紫外吸收，化学测定和电镜观察等方面的鉴定，本实验采用紫外吸收法。
2. 肝脏中DNA的提取及纯度鉴定原理：在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物-核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白形式存在的，因此，在制备核酸时，需先将组织或细胞匀浆或破碎，使之释放出核蛋白，再设法将这两大类蛋白分开，再通过蛋白质变性如苯酚，氯仿等，去垢剂如十二烷磺基硫酸钠或使用蛋白酶处理，除去蛋白质，使核酸与蛋白质分离，从而将核酸与蛋白质分离开。RNP和DNP在不同浓度的电解质溶液中的溶解度差异很大。如在高浓度氯化钠（12mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在低浓度氯化钠溶液中（0.14mol/L）,DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大。因此，可以利用不同浓度的氯化钠，将两者分离。将抽提得到的核蛋白用SDS或苯酚处理使核蛋白解聚，DNA/RNA及与蛋白质分开；用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA 则溶解于溶液中。经上述分离纯化后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，而使其在适当浓度的亲水有机溶剂（如乙醇）中呈絮状沉淀析出。重复进行上述处理，即可制成所要求纯度的脱氧核糖核酸制品。提纯的DNA或DNA钠盐为白色纤维状固体。为了防止DNA酶解，提取时加入EDTA。因为EDTA是抑制DNA酶活性最好的抑制剂之一，由于DNA 酶的酶解作用必须有Ca2+及Mg2+的存在，故只要在提取液中加入少量的金属螯合剂EDTA，就可使DNA酶失活。本实验采用动物新鲜肝脏为提取DNA的材料，通过组织匀浆，使细胞破碎，利用RNP和DNP在一定浓度氯化钠溶液中溶解度不同的特点，提取DNP。用SDS使蛋白质变性和核蛋白解聚，释放出DNA。用氯仿使蛋白质变性沉淀，离心去除。用乙醇作沉淀剂，得到较纯的DNA。用Rnsae去除RNA，再用氯仿使酶蛋白变性沉淀，离心去除，最后用乙醇作沉淀剂，得到更纯的DNA。DNA纯度鉴定需要测定A260，A230和A280的值，经验数据表明，高纯度DNA样品A260/A280的值在1.9左右，当比值高时说明样品中混杂有RNA，当比值低时表明样品中蛋白质没有脱净；而A260/A230应大于或等于2.0，若比值过小则表明有杂质（一般多酚类或色素）。因此，可利用A260/A280和A260/A230比值的大小来鉴定DNA样品的纯度。
3. 二苯胺法测定核酸的含量原理：脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
DNA HO CH2C — CH2 CHO 蓝色化合物
酸性条件二苯胺
==
O
ω—羟基—γ酮基戊醛
4.DNA的琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm 紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。
琼脂糖凝胶浓度/% 可分辨的线性DNA大小范围/kb
0.3 60-5
0.6 20-1
0.7 10-0.8
0.9 7-0.5
1.2 6-0.4
1.5 4-0.2
2.0 3-0.1
表5-1 DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系
1.实验仪器与试剂：
1.实验试剂
（1）以小白菜为材料提取DNA
（2）研磨缓冲液：1mol/氯化钠，0.045mol/L 柠檬酸三钠盐，0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（Na2-EDTA），1%的十二烷基硫酸钠（SDS）,并调到PH=7.0.
（3）氯仿-异戊醇（V/v）：氯仿：异戊醇=24:1
（4）95%乙醇溶液
（5）RNase溶液
（6）TE溶液：含10mmol/L的Tris-HCL, 1mol/L的Na2-EDTA。
动物新鲜肝脏（猪）。
（7） 4mol/L 氯化钠溶液：将233.84g氯化钠溶于水，稀释至1000mL.
（8） 0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液：溶解8.18g氯化钠及37.2g 乙二胺四乙酸钠于蒸馏水，稀释至1000mL。
（9） 10%的SDS溶液：25g 十二烷基硫酸钠溶于100mL 蒸馏水中。
（10） 15mol/L氯化钠-1.5mol/L柠檬酸三钠溶液：0.88g氯化钠和0.44g柠檬酸三钠溶于蒸馏水中，稀释至1000mL.
(11) 1.5mol/L氯化钠-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液：87.66g氯化钠和44.12g柠檬酸三钠
溶于蒸馏水中，稀释至1000mL.
（12）ＲＮａｓｅ溶液（10mg/mL）：将RNaseA 10mg 溶解于1mL TE 缓冲液中。
（13）70%乙醇，95%乙醇。
（14）DNA标准溶液：取小牛胸腺DNA用0.1N氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。（15）DNA样品液：（自己提取）控制其DNA含量在50~100微克/毫升左右。
（16）二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。临用前加入1毫升
1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。（17）限制性内切酶HindⅢ试剂盒
（18）标准λDNA：按使用说明配制
（19）标准pBR322：按使用说明配制
（20）电极缓冲液（5×TBE）：用前稀释10倍
称取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸馏水定容
至200ml。使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀释缓冲液（0.5×TBE）。
（21）溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/ml）：1滴/组
将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是
诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是
沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。
（22）1%琼脂糖
2.实验器材
离心机；752紫外分光光度计，研钵，三角瓶，烧杯，玻璃棒，匀浆器，离心管，恒
温水浴箱（60度，100度），量筒，吸量管，真空干燥器，紫外分光光度计，石英比色皿，电泳仪，电泳槽，微量移液器，紫外检测灯，移液管（1、2、5ml）,试管及试管架，凝胶
塑料托盘，大小烧杯，一次性塑料手套，紫外反射投射仪，洗瓶，胶头滴管，卡尺。
操作步骤：
1.植物组织中DNA的提取及纯度鉴定（小白菜）
（1）从冰箱取出冷冻30min以上的小白菜幼嫩组织剪碎，放入研钵中并加入12ml研磨缓冲液研磨成匀浆。
（2）将匀浆倒入三角瓶内，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分震荡半分钟，以脱组织蛋白，然后离心（10000r/min）5min，小心地吸出上层清液备用，弃去中
下层含有细胞碎片，变性蛋白质，氯仿等残物。该过程循环2~3次（3）将收集的上层溶液倒入三角瓶中，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分震荡半分钟，以脱组织蛋白，然后离心（10000r/min）5min，用吸管吸出上层核酸
水同液，移于烧杯中。
（4）用吸管沿烧杯壁缓缓加入2倍体积预冷95%的乙醇，然后用玻璃棒轻轻搅动，将出现的纤维沉淀缠绕在玻璃棒上。
（5）将上述沉淀溶解在PH=8.0, 2ml的TE溶液中，搅拌到完全溶解后，加入RNase 溶液，使其最终浓度为50-75ug/mL,在37度下保温30min，以除去RNA，然后加入
等体积氯仿-异戊醇混合液，在三角瓶中，震荡半分钟，离心（10000r/min）5min。
收集上层水溶液，再次除去残留的蛋白质和所加的RNase.
(6) 按照4的程序加乙醇后，将DNA沉淀挑出(若是无法挑出DNA沉淀，则离心5min
（10000r/min），弃去上清液，底部为DNA沉淀)，再将DNA溶解于PH=8.0的2ml
的TE溶液中，即得到纯化的DNA溶液。
（7）DNA纯度测定。采用DNA紫外吸收特性进行测定，取少量样品，加PH=8.0的TE
溶液稀释至一定浓度，测A260和A280的值，如A260/A280=1.8，蛋白质含量不超过1.3%，DNA纯度合乎质量标准。
NDA浓度（ug/mL）=×稀释倍数
（L为比色杯厚度，一般为1cm; 0.020为每mL溶液中含1ugDNA钠盐时的吸光值；A260为260nm波长处光吸收值）
2. 肝脏中DNA的提取及纯度鉴定
（1）取新鲜肝脏（约10g）,用0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液洗去血液，剪碎，加入10mL 0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液,置匀浆器中研磨，待研成糊状后，浆糊状物离心5min（10000r/min）,弃去上清液，沉淀
用0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液洗2-3次。
（2）向上述沉淀物加入0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液，使总体积为4mL,然后滴加10%SDS溶液0.5mL,边加边搅拌。加毕，置60度水浴保温10min(用
细玻璃棒经常搅拌)，等溶液变得粘稠时（可能不明显）取出冷至室温。此步操作
系使大分子脱氧核糖核蛋白从细胞核中溶出，核酸与蛋白质分离。
（3）加入4mol/L氯化钠溶液1.6mL,使氯化钠最终浓度达到1mol/L搅拌10min，加入约1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇20min，离心5min（10000r/min）.收集上层
水相，去掉在氯仿与水相之间的变性蛋白质沉淀；向上层水相徐徐加入1.5-2倍预冷的95%乙醇，DNA沉淀即析出，离心5min（10000r/min）去掉上清，收集沉淀（DNA 粗品）。
（4）将DNA粗品置于2.7mL0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中溶解，再加入0.3mL1.5mol/L氯化钠-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液,搅匀，加入1倍体积的氯
仿-异戊醇混合液，震摇10min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相
（含NDA钠盐），弃中层变性蛋白；收集上层水相再加入一倍体积的氯仿-异戊醇
混合液，震摇10min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相，弃中层变性蛋白。反复几次直到中间层蛋白凝胶层消失。向收集的上层水相加入2倍体积预冷的95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心5min（10000r/min），弃去上清液，沉淀为
较纯的DNA.
（5）将上述所得沉淀溶于2mLTE缓冲液中，加入RNaseA溶液至终浓度为20mg/L混匀，在37度水浴中保温30min。
（6）向经RNaseA 消化后的DNA溶液中加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇5min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相（含DNA），弃中层变性蛋白,重
复抽屉2-3次。
（7）向除尽蛋白质的上清液中徐徐加入2倍体积预冷的95%乙醇，DNA及沉淀析出。离心5min（10000r/min），弃去上清液，再用预冷的70%乙醇洗一次，室温倒置干燥。
（8）将上步所得更纯的DNA沉淀溶于2mL 0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中备用（供定性鉴定或定量测定）。
（9）将DNA样液适当稀释，移入光径为1cm的石英比色皿，并以0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液作为空白对照。在紫外分光光度计上分别于
260nm,280nm和230nm波长处进行测定，计算A260/A280和A260/A230比值的大小来鉴定DNA样品的纯度。
3. 二苯胺法测定核酸的含量 （一）DNA 标准曲线的制作
取8支试管，编号，按下表加入试剂
管号 试剂 0
1 2 3 4 5 6 7 DNA 标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1..8 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0 二苯胺试剂
4 4
4
4
4
4
4
4
加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml ）为横坐标，绘制标准曲线。 （二）样品的测定
取2支试管，各加0.2ml 待测液加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。
DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数
100
10
)(/(%)6
???=
g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率
4. DNA 的琼脂糖凝胶电泳（实验一，二样品） 一、DNA 电泳样品制作
取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf 管，编号，分别加入25μL 样品溶液，然后加入5μL 6×电泳缓冲液，混匀，放入冰箱保存。 二、1.0%琼脂糖凝胶板的制备
1. 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm ），梳齿底边与托盘表面保持0.5-1mm 的间隙，安置好后保持静置状态。
图5-1 凝胶托盘的组装
1. 托盘
2. 挡板
3. 梳子
2.称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30mlTBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产生泡沫。
3.待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60℃）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。
4.待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。
5.取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。
三、加样
用微量注射器或移液枪样品液，分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5×2×2.5mm）容积约为25μL，因此加样量不要超过20μL，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。
四、电泳
加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm。当染料带移动到距离凝胶末端约1cm时，停止电泳。
五、观察
小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长245nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。观察时应带上防护眼镜，避免紫外灯对眼睛的伤害。
六、制作测定分子量标准曲线
用卡尺量出λDNA-HindⅢ酶解各片段的迁移距离（cm），以DNA酶解各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子
量的标准曲线。λDNA-HindⅢ酶解各片段大小见表5-2。
片段碱基对数目（kb）道尔顿（×106）
1 2 3 4 5 6 7 8
23.130
9.419
6.557
4.371
2.322
2.028
0.564
0.125
15.0
6.12
4.26
2.84
1.51
1.32
0.37
0.08 表5-2 λDNA-HindⅢ酶解片段
实验结果：
1.植物组织中DNA的提取及纯度鉴定
波长/nm 260 280
吸光值A 1.614 0.924
比值260（nm）/280（nm） 1.747
2.肝脏中DNA的提取及纯度鉴定
波长230 260 280
吸光值A 2.212 3.554 2.373
吸光值比值260（nm）/280（nm）=1.498
260（nm）/230（nm）=1.607
3.二苯胺法测定核酸的含量
DNA含量标准曲线的绘制
试管标号0 1 2 3 4 5 6 7 DNA浓度
（ug/ml）
0 0.2 0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0
光密度A 0.00 0.016 0.033 0.073 0.093 0.114 0.152 0.190
利用二苯胺法测定样品中核酸含量（在波长为595nm环境下进行紫外吸收，且样品稀释了10倍）
样品类型小白菜组织中的DNA 肝脏组织中的DNA
吸光值A 0.015 0.024 DNA浓度(ug/ml) 1.86 2.79
DNA产率（%）0.618*10^-4 0.547*10^-4
4.DNA的琼脂糖凝胶电泳（实验一，二样品）
通过琼脂糖凝胶电泳后将电泳结果在紫外线下照射观察出了如图所示的条带。本组实验结果条带为最下面的两条。DNA标准样品条带也成功跑出。
Mark
er
DNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Mr
（kD a）10000 800
6000 5000 4000 3000 250
200
150
1000 750 500 250
Log
Mr 4.00 3.9
0 3.78 3.70 3.60 3.48 3.4
3.3
3.1
8
3.00 2.8
8
2.7
2.4
样品
迁移
距离
（cm
）
1.7 1.8 1.9
2.0 2.1 2.3 2.5 2.8
3.2 3.7
4.1 4.7
5.4
染料
迁移
距离
（cm
）
6.2
相对
迁移率（MR ）0.27 0.2
9
0.31 0.32 0.34 0.37 0.4
0.4
5
0.5
2
0.60 0.6
6
0.7
6
0.8
7
肝脏小白菜Marker
样品DNA条带①空心菜DNA条带 ②动物肝脏DNA条带 样品迁移距离（cm） 5.9 5.7
染料迁移距离（cm） 6.8 6.6 相对迁移率MR 0.867 0.864 样品DNA分子量（Mr）233 237
分析与讨论：
1.小白菜DNA提取实验的过程中，我们组提取的蛋白沉淀明显偏少这说明我们对白菜的研
磨程度不够，应该把小白菜研磨的更加细。在这一组实验的过程中我们组在重复去除细胞
碎片，变性蛋白质，氯仿等残物时取得上清液不多造成DNA的遗失。所以以后在用玻璃棒
缠纤维沉淀时，无法缠绕上。我们组采取了离心的方式将其沉淀在离心管的底部。然后按照实验步骤去除残余RNA物质。我们组所测得的DNA吸光度比值为1.747，比较接近标准的1.8。我们的提纯步骤还是比较成功的。就是所得样品有点少。
2.在做猪肝脏的提取过程中，肝脏的研磨程度可能不够精细，而且肝脏组织比较难研磨，而且还是冷冻的肝脏，所以我认为这一点可能有影响。在肝脏重复洗涤的过程中我们采取了离心的方式来洗涤肝脏沉淀，所以我认为这个可以更好地去除上清液的杂质。在分离核糖和蛋白质的过程中，我们的溶液也并不粘稠。后来我们在进行抽取上相水层，去除中层变性蛋白。该过程中我们除杂不够完善，操作不够精细，导致少量中层变性蛋白混入DNA。本次实验吸取了上次实验教训，我们的产物量很多。但是除杂不够完全。在进行吸光度测试时，我们稀释了30倍，但是我们的吸光度依旧偏高，因为杂质的影响，所以吸光度比值不太接近1.8。
3.我们组在弄DNA标准曲线时，操作还是满规范的，我们最后所得拟合趋势线的R平方达到了0.999的精度。然而我们在做样品的测定时，由于小白菜DNA样品较少且全为未稀释样品，所以我们只取了0.02ml的样品稀释十倍，在坐这个实验时进行沸水浴的过程时间超过了15min.可能过度的时间会对实验结果造成影响。我们在算出的产率中可以看到，第一个实验中的DNA产率有点偏低，所以第一个实验虽然纯度高但是产率低，在第二个试验中，得到的DNA虽然产率相对于其他组较多但是纯度就没有第一组的高。本组实验比较成功。
4.DNA的琼脂糖凝胶电泳实验，这个实验我们犯了错误，这个实验是两个小组共用一块胶板的，我们凝胶板的制作的过程还是可以的，但是我们在加样品之前忘记了对样品加入6X电泳缓冲液。完全照搬实验材料上的步骤，导致了第一次失误，然后进行第二次实验，在这次实验过程中因为，个人操作原因（手抖），加样品时将琼脂糖凝胶刺穿了，加样品失败。（上图中从下向上，第三个胶槽）可以发现该DNA染料只跑了三分之一不到。然后再第一个胶槽重新加样。我们组的实验所用胶槽是从下向上的三个。感觉跑的还可以。主要还是要加样时注意不能破损凝胶。另一组的实验可能也是因为加样品的问题，导致少了一条带。
实验心得：
本次实验化学综合实验，锻炼了我们独立处理问题的能力，在以前的实验课中我们的化学试剂都是配好的，我们直接拿过来就用，在这次的综合实验中，很多试剂都得自己配，这锻炼了我们独立解决问题的能力。而且在本次实验给的指导书中有很多的所需溶液是要根据试验情况进行自我计算的。并不像以前的试验中直接对着实验报告加试剂。而且本次实验过程中老师给予的知道是很少的。这个实验的过程中很多的细节都得自己想方法处理。本次生物化学综合实验也让我们明白组与组的合作的，很多的数据都是个人进行计算，然后几个一起综合讨论得出一致的结果。这个大大提升了我们的办事效率，加强了同学之间的合作交流。同时，更好地让我们组员之间合作，不浪费时间，在保证准确性的条件下，合理分配时间。我们在第二天做实验时，我们发现第四个实验与第三个实验并无冲突的条件下，先做第四个实验，然后再利用第四个实验电泳的等待时间，来完成第三个实验，节约了时间。
不仅如此，本次实验时间是所有实验中最长的，整天都在实验室中，锻炼了我们的耐性。也让我们明白做科学研究，要耐得住性子，要坚持。同时，也暴露出实验过程中的冒失，
例如在第四个实验室待测样品忘加入6X电泳缓冲液，我们太过于依赖实验指导材料，未联系以前所做的类似实验的步骤。在加入样品的时候有点急躁导致凝胶被刺穿。这都反应了我们还要继续做实验，积累经验。另外我们在实验的过程中要如实记录数据，遵循客观事实。不可以为了节省时间，就去“借鉴”别人的数据，这是不诚实的行为。同时，这个并不能锻炼我们的个人能力。不能懒惰不做实验，对待事情时要有积极的态度。总之做实验这个过程让我学到了很多，也能够更加自主的去完成实验。
参考文献：
[1] 易庆平,罗正荣,张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J]安徽农业科学2007 (25)
[2] 韩玉杰,贾炜珑,王自霞,周小梅.几种提取植物DNA方法的比较[J]山西农业科学2008 (07)
[3] 张宁,王凤山.DNA提取方法进展[J]中国海洋药物. 2004(02)
[4] 李军,郭晏海,党琳.几种药用植物DNA提取与纯化方法的比较[J]陕西中医学院学报. 2002(05)
[5] 邱芳,伏健民,王斌.从植物细胞核分离大分子量核DNA[J]植物学报1999(11)
[6] 鲍毅新,孙波,张龙龙,赵庆洋.对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测[J]浙江师范大学学报(自然科学版)2009(03)
[7] 邵碧英,杨婕,张体银.动物产品的DNA提取方法[J]畜牧与兽医2005(09)
[8] 汪薇,王诗航.光密度值测定在实验医学研究中的应用及意义[J]解剖科学进展2006(03)
[9] 康熙雄,耿会娟,王雅杰.电泳技术的临床应用[J]中华检验医学杂志2007(11)
[10]方宣钧,孔巍,金芜军.快速一步法(ROSE法)提取DNA应用于RAPD-PCR扩增[J]高技术通讯1997(10)
生物化学实验报告 2011
孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料小麦面粉(1000 g) 2．主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2）滤纸（3）烧杯：100 mL×2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2； 10 mL×1 （7）恒温水浴锅（8）煤气炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。 （5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线 批阅教师：年月日
生物化学实验报告
一、实验目的： 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术： 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术： 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术： 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术： 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术： 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型
3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理： 1、蔗糖酶的提取： ①酵母菌的基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法： （1）机械（匀浆）法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机（0.5-1L） 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机（XL） 高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。 优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 （2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
生物化学实验报告册
生物化学实验报告册 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入
水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。 实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。 1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3．每项内容的基本要求 实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪
生物化学实验报告册模板
生物化学实验报告 姓名：李燚 学号： 3180100093 专业年级： 2018级护理学本科 组别：第五实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量操作考试 实验日期2019-12-24 实验地点第XX实验室 合作者张怡君指导老师李某某 评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项； 2.熟练运用溶液混匀的各种方法； 3.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器； 4.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定的原理和注意事项，掌握其操作方法。 二、实验原理 三、材料与方法：以流程图示意 （一）实验材料 1.样品：鸡肝 2.试剂： （1）95%乙醇； （2）0.31mol╱L（5%）三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（CCl3COOH）5g，加蒸馏水溶解至100ml；
（4）12mol ╱L HCl ：浓HCl 原液（36%-38%）； （5）12.5mol ╱L （50%）NaOH ：称取NaOH 50g ，用蒸馏水溶解至100ml ； （6）碘试剂：碘100mg 和KI 200mg 溶于50ml 蒸馏水中； （7）班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5NaO7 ?5H2O ）173g 和无水碳酸钠（Na2CO3）100g 溶于蒸馏水700ml 中，加热促溶。冷却，慢慢倾入17.3%硫酸铜（CuSO4?5H2O ）100ml ，边加边摇。再加蒸馏水至1000ml ，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。 3.仪器和器材： （1）普通离心机，室温至100℃恒温水浴箱（×2），723型可见光分光光度计，精度为10mg 级电子天平（×1）；（2）剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1）；（3）试管架（×1），10ml 离心管（×2），(15㎜×100㎜)试管（×6）；（4）刻度吸量管（2ml ×1，5ml ×2），1000μl 微量可调取液器（×1）； （二）实验方法 1.肝糖原的提取与鉴定的实验的流程图： ＋ 5%CCl3COOH 1 ml ＋5%CCl3COOH 3 ml
浙江大学生物化学丙实验报告1
实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶的提取 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法； 2、巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 1、实验内容： 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理： ①酵母细胞破碎 细胞破碎的常用方法 液体剪切法固体剪切法压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 ②蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂
1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3～4人） 2、实验试剂 石英砂，95%乙醇(-20℃），20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平（称量干酵母粉）；研砵（每组一套）；50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）；高速冷冻离心机；恒温水浴箱（50℃）；量筒（50ml）、微量移液枪（1000ul)及枪头或移液管（1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架；制冰机；－20℃冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹（干磨法） ①称量：称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨)：至尽可能成细粉末状（约15min） ③加液+研磨：量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加研磨10min， 使呈糊状液体； ④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后(托盘天平上)，离心10min （条件：4℃、12000r/min） ⑤收集+测量：收集上清液并量出体积V1（样品I），另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理：将上步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴，保温30min， 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min。 （条件：4℃，12000r/min） ④收集+测量：收集上清液并量出体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀 ①冰浴：将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
生化实验报告模版
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗
入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得；Vi可g×Wr求得。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。
生物化学实验六——酵母RNA的提取与含量测定 山东大学实验报告
实验六——酵母RNA的提取与含量测定 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10 同组者：张奕 一、实验目的 1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用。 3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm 左右，且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比（浓度为5μg/ml—45μg/ml吸光度与浓度成正比），利用此性质，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右)，测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收，对核酸测定有一定的干扰作用，最大吸收峰在280nm处，原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度，再测280nm处的吸光度，通过计算消除其对核酸的影响。 三、实验器材 干酵母粉 电子天平 量筒 容量瓶100ml 磁力搅拌器 试管 100℃水浴锅pH试纸（pH1-14）烧杯 离心机 722型分光光度计锥形瓶 离心管 四、实验试剂 0.2%氢氧化钠溶液95%乙醇 无水乙醚酸性乙醇（5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀）RNA标准蛋白溶液（200μg/ml）
1.RNA的提取 （1）称取4g干酵母粉，放入200ml锥形瓶中，加入40ml0.2%的氢氧化钠溶液混匀，在沸水浴中煮沸30min中并冷却； （2）冷却后，把液体倒入离心管中，在4000r/min的条件下离心15min； （3）离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，边加边搅拌，静置5min左右，再4000r/min的条件下离心5min； （4）离心后保留沉淀，用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后在3000r/min的条件下离心5min； （5）离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次，每次用3000r/min离心5min； （6）离心结束后，收集沉淀与滤纸上，称重备用。 2.RNA样液的配制 （1）取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中，加入5mlNaOH溶液，搅拌，溶解，调成糊状。 （2）再加入蒸馏水40ml，搅拌混匀，调PH至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。 （3）再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。 3.RNA标准曲线的绘制 （1）取洁净的试管，依次标号为1-10、A、B、C后，按照下表分别往各试管中加所需液体，并用磁力搅拌器混匀。 （2）混匀后以0号试管为参比液，在260nm下测各试管的吸光度A，并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线，并最终得出样品的浓度。 六、注意事项 1.离心机的使用，使用前一定要将两离心液（包括外壳）在天平上调平，对称放置在离 心机上，防止力臂不对称而损坏离心机。 2.紫外分光光度计的使用，要先预热10分钟，往比色皿中到液体只需到三分之二即可， 防止液体溢出腐蚀仪器，爱护仪器。
生化大实验实验报告
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；
生物化学实验报告
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
大学生物化学实验
生物化学实验安排 实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、实验原理 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 3.苯环的黄色反应 Tyr + 浓硝酸黄色 Trp Phe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色 4. 乙醛酸的反应： 检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。 5. 偶氮反应
偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。 6. 醋酸铅反应 ()↓ --→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr 三、实验步骤 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml 和10%NaOH 约2ml ，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。观察现象，记录。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) （1）取2支试管分别加入蛋白质溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml ，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混匀，沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。 （2）在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。 3. 苯环的黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。鸡蛋清溶液（蛋清：水= 1：9） 4. 乙醛酸的反应： 向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。蛋白质溶液（蛋清：水= 1：20）
生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生化实验报告资料
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
浙江大学生物化学丙实验报告5
实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称：蔗糖酶分离纯化产物的SDS －PAGE 检测分析及蛋白质相对分子质量测定 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法 2、蔗糖酶分离纯化产物的SDS －PAGE 检测分析 3、学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法 二、实验内容和原理 （1）实验内容 1、SDS －PAGE 凝胶制作； 2、蔗糖酶分离纯化产物的SDS －PAGE 电泳分离； 3、洗脱测定并计算相对分子质量。 （2）实验原理 1、电泳 是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。 2、电泳法分离、检测蛋白质混合样品 主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所产生的电泳迁移率的差别。 3、区带电泳 是样品物质在一惰性支持物上进行电泳,因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。 4、聚丙烯酰胺凝胶（PAG) 由丙烯酰胺和交联试剂N,N ’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在有催化剂（如过硫酸铵或核黄素）和增速剂（如N,N,N ’,N ’-四甲基乙二胺，TEMED ）的情况下聚合而成的。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，这主要是由蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程中仍保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。 6、聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为 ⑴连续系统凝胶缓冲液的pH值及凝胶浓度不变。该电泳系统具有电荷效应、分子筛效应； ⑵不连续系统凝胶缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度、电位梯度不连续，由浓缩胶和分离胶组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。该电泳系统具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 7、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 以PAG为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带静电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。为消除静电荷对迁移率的影响，在整个电泳体系中加入一定量的阴离子去污剂“十二烷基硫酸钠（简称SDS）”和“强还原剂（巯基乙醇）”后，蛋白质样品就会与SDS结合形成带负电荷复合物，而SDS作为一种变性剂和助溶剂，它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键，并结合到蛋白质分子上，使分子去折叠，破坏蛋白质分子内的二级和三级结构，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。另外，SDS－蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，可打开蛋白质分子内或肽链间的二硫键，并能避免重新氧化，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。蛋白质亚基的电泳的迁移率主要取决于亚基的相对分子质量大小，而电荷的因素可以忽略。 8、蛋白质亚基相对分子质量的测方法 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质－SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只主要取决于它的椭圆棒的长度即蛋白质的相对分子质量的大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。由于蛋白质的相对分子质量不同，所形成复合物的相对分子质量不同，在电泳中反映出不同的迁移率。当蛋白质或亚基的相对分子质量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与相对分子质量的
浙江大学生物化学丙实验报告.
. 实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 质粒DNA 的微量制备及电泳检测 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。 二、实验内容和原理 1、实验内容 ①质粒DNA 的提取 ②DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 2、实验原理 ①质粒： 质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA 分子，大小在1-200kb 之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 ②从细菌细胞中抽提质粒DNA 的步骤： a 细菌培养使质粒大量扩增； b 收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ； c 进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质，分离和纯化质粒DNA 。 ③碱裂解法来分离纯化质粒DNA ： 在EDTA 存在下，经过SDS 处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH ）， 使核质体DNA 与质粒DNA 的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异，质粒DNA 很快得以复性，而细菌核质体DNA 分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 3130100246 日期： 2015.6.9 地点： 生物实验中心310 装 订 线
浙江大学生物化学丙实验报告1
专业：农业资源与环境 姓名：李佳怡 ____________ 学号：_J6 _______________ 日期： __________________ 地点：生物实验中心310课程名称：生物化学实验（丙） 实验名称：蔗糖酶的提取 一、实验目的和要求（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 七、实验结果与分析（必填） .指导老师：方祥年 成绩:_ _同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛 二、实验内容和原理（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、 巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 订 1、实验内容: 线 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ① 酵母细胞破碎 液体剪切法―超声波法.机械搅拌法.高压匀浆法 固体剪切法一压力和研磨 非机械法——> 物理法.化学渗透法.酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取岀 来。 ② 蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集 样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 实验报告 细 胞 破碎 的 常 用 方 法
三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉10g/组（3?4人） 2、实验试剂 石英砂，95%乙醇（-20*0,20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平（称量干酵母粉）：研碎（每组一套）：50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）：高速冷冻离心机：恒温水浴箱（50°C）；量筒（50ml）、微量移液枪（lOOOu 1）及枪头或移液管（1ml）、玻棒、滴管等;离心管（留样品I、II用）及离心管架：制冰机：一20°C冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹（干磨法） ①称量：称取市售干酵母粉10計约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨（干磨）：至尽可能成细粉末状（约15min） ③加液+研磨：呈:取总体积40 ml的20mmol几Tris-HCl缓冲液，分2次加研磨lOmin, 使呈糊状液体； ④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后（托盘天平上），离心lOmin （条件:4°C、12000r/min） ⑤收集+测量：收集上淸液并量出体积VI （样品I）,另留1ml上淸液（样品I ）放置一20°C冰箱保存 用于蔗糖酶蛋白含量测眾、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理：将上步抽提液（样品I）,迅速放入50°C恒温水浴，保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min a （条件：4°C, 12000r/min） ④收集+测量：收集上淸液并量出体积V2 （样品II）,另留1ml上淸液（样品II ）放宜一20°C冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测左、测左蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀 ①冰浴：将热处理后的上淸液加入相同体枳的一20°C的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
浙江大学生物化学丙实验报告
. 实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理 （1）实验原理 1、离子交换层析： 以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 基质 基质 — ＋ — ＋ 可逆交换 可逆交换 溶液中的离子 （交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖) 阳离 阴离子交
由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。 本实验采用 3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热（100℃）被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 （2）实验内容 1、离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品Ⅲ； 2、定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ① DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)； ②20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；