细胞培养污染简介

3，支原体污染
3.1，支原体污染是目前实验室中最为常见的污染细胞的原核生物。 因支原体属于直径介于0.2左右的最小原核生物，形态易变，故极
易通过滤膜而逃过培养液的过滤除菌步骤。在细胞培养液中，支原体 可达到107-108CFU/mL （CFU=Colony Forming Unit，支原体浓度测量 单位）而不使培养液混浊及影响细胞生长。多种支原体对细胞不产生 任何病变效应，使得细胞污染不易被察觉。据报道，目前世界上有3050%的细胞株已受支原体污染。但是支原体对干细胞培养的影响甚大， 胚胎干细胞受支原体污染形态、生长速度等均出现改变。
我们的目标
二，污染是细胞培养的大敌。保证细胞株不受污染是细 胞库保藏能力的关键性标志，也是其他能力提升的基础
1，细菌污染 2，真菌污染 3，支原体污染 4，内毒素污染 5，细胞间交叉污染
1，细菌污染。
实验室中因操作不慎而引起的污染，即使在细胞培养液中加入了预 防剂量的抗菌素也会产生。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌，以 及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液 肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。污染后细胞发生 病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成实验失败和 细胞株(系)丢失。
• 2014年10月，国务院印发《关于加快科技服务业发展的若干意 见》（国发〔2014〕49号），这是国务院首次对科技服务业发展 作出的全面部署。
（国家对我们的要求）
细胞资源为生物医药基础研究和产业发展提供支撑和保障细胞Fra bibliotek源保藏和技术研发
基础研究实验细胞库
人类遗传资源库
国家发展和安全战略
一， 细胞系是重要的遗传资源。细胞库的功能包括 资源保藏能力、资源利用能力和资源开发能力。这 三方面的提升是建设一流细胞保藏单位的关键抓手， 也是推动细胞库向科技服务业转移重心的必经之路。
坚持国际接轨的细胞保藏技术水平，积极吸引国内 有知识产权的细胞系进入细胞库保藏，逐步形成自
己的特色。
中科院 细胞库
坚持用户至上的服务态度，全方位为用户着想为用 户服务，积极推动库内细胞资源的利用。
密切关注国际细胞生物学发展前沿，主动与医院等 单位合作，拓宽细胞资源的种类，为我国细胞生物
学的进一步发展做好准备。
细胞库
瞄准科技发展前沿 提升利用开发水平
细 质 文鉴 胞 量 档定 培 控 管检 养 制 理测
拓宽收集渠道 提升保藏特色
保藏、评价
技技对培 术术外训 咨服供科 询务应普
开放、共享
一， 细胞系是重要的遗传资源。保存细胞系的细胞库其功能包括资源保 藏能力、资源利用能力和资源开发能力。这三方面的提升是建设一流细 胞保藏单位的关键抓手。
可污染细胞的支原体种类较多，主要有Mycoplasma orale, M.hyorhinis, M.arginini 和 Acholeplasma laidlawii。目前已
发现的支原体超过100种，这就是单一的检测方法有时会失败的原 因之一。我们建议至少选择2种方法来检测支原体。
3.2，常用支原体检测方法 3.2.1，肉汤培养基检测法。医药行业规定使用。 3.2.2，间接染色法检测支原体 用待检测的细胞培液培养Vero细胞，然后用显微镜观察是否有 支原体感染。Vero细胞来源于正常的成年非洲绿猴肾组织，由Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年在日本Chiba大学分离得到。 Vero细胞是非整倍体，可在培养液中无限生长，常用来生产疫 苗，检测支原体和细菌外毒素等。细胞培养液中的支原体可用 Hoechst33258或DAPI染色后观察到。由于支原体含有DNA，染色 后在细胞表面，培养基中及培养皿表面呈现出荧光小点。
细胞培养污染简介
用创新驱动科技服务业的发展
• 十八大明确提出要“实施创新驱动发展战略，强调科技创新是 提高社会生产力和综合国力的战略支撑，必须摆在国家发展全局 的核心位置”。
• 我国科技服务业已经具备一定的发展基础，但是与英、美等发 达国家相比，我国的科技服务业产值及其占GDP比重较低，2011 年度实现科技服务增加值不足7000亿元，占GDP比重约为1.4%。
在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁 换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。
由于多数细胞受支原体污染后无明显变化或略有变化，若不及 时处理，将产生交叉污染。另外，支原体会改变宿主细胞的结构和 功能等一系列特征，因此尽管很多受支原体污染的细胞其形态看不 出变化，但对其进行进一步分子生物学分析时，其实验结果会不准 确。为此建议各实验室定期对细胞进行支原体检查。
二， 保证细胞株不受污染是细胞库保藏能力的关键 性标志，也是其他能力提升的基础。
一， 细胞系是重要的遗传资源。由细胞 库（Cell Bank）负责保存细胞系。
细胞库
细 质 文鉴 胞 量 档定 培 控 管检 养 制 理测
技技对培 术术外训 咨服供科 询务应普
保藏、评价
开放、共享
一， 细胞系是重要的遗传资源。负责保存细胞系的细胞 库应当开发、承担更多的功能，提升服务科技、服务社 会的能力，产生更高的服务业产值。
2，真菌污染
在细胞培养过程中较为常见，尤其在南方霉雨季节进行细胞培养更易 产生。最常见的真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌 等。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色小点，培 养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝纵横交 错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散 在细胞周边和细胞之间。
间接染色法检测支原体
A
B
C
Vero细胞DAPI染色荧光照片(400×)。A，感染支原体的 Vero细胞。蓝色卵圆形荧光物质为Vero细胞核，其周围蓝 色荧光小点为支原体(箭头)；B，未感染支原体的阴性对照 Vero细胞；C，加入待检培养液的Vero细胞(未感染支原体)。
3.2.2，PCR法检测支原体 许多支原体检测方法不仅用时长而且复杂，有的方法仅限于检 测有限种类的支原体。PCR检测法灵敏度高，特异性强，只用一 天时间即可快速检测细胞培养液中的支原体，是一种检测支原 体的有效手段。中科院干细胞库选择支原体16S rDNA序列为靶 序列设计引物，同时做对照组实验和干扰实验以避免假阳性或 假阴性结果，取得了很好的效果。