IHNV核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

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IHNV核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

IHNV核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定
2 9 ( 3 ) : 3 6 -4 0 华 北 农 学 报 ·2 0 1 4 ,
IHNV 核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中 的表达及鉴定
1, 2 1 2 谢三磊 , 王雯慧 , 孙惠玲 ( 1. 甘肃农业大学 动物医学院, 甘肃 兰州 730070; 2. 北京市农林科学院 畜牧兽医研究所, 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室, 北京 100097)
Expression and Identification of Nucleocapsid Protein of IHNV in Baculovirus Expression System
2 XIE Sanlei1, , WANG Wenhui1 , SUN Huiling2
( 1. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China) Abstract: To study the major structural nucleoprotein ( N ) of infectious hematopoietic necrosis virus ( IHNV ) by baculovirus systems, in this study nucleoprotein ( N) gene( 1 176 bp) was amplified by RTPCR from infectious hematopoietic necrosis virus ( IHNV) and inserted into the baculovirus vector pFBLICBse to construct a recombinant plasmid pFBLICBseN. The constructed recombinant transposition plasmid pFBLICBseN was transformed to competent E. coli DH10Bac to get recombinant bacmids rBacmidN. The obtained recombinant bacmid rBacmidN was transfected to insect Sf9 cells, and the recombinant baculovirus that contained N gene was obtained. IFA and Western Blot analysis showed that the recombinant N protein can be recognized by horseradish peroxidase ( HRP ) labeled histidine monoclonal antibody ( antiHis) which indicated IHNV N gene has been successfully expressed in Sf9 cells infected with recombinant baculovirus. The study laid a foundation of further study on N protein structure , function and immunological characteristics. Key words: Infectious hematopoietic necrosis virus; N gene; Recombinant baculovirus 传染性造血器官坏死病( Infectious haematopoietic necrosis, IHN ) 是鲑、 鳟鱼类的一种以造血组织 严重坏死、 显著贫血、 肝、 脾、 肾褪色为主要特征的传 染性疾病。不同种类鲑、 鳟鱼类对病原的易感性不 同。病原为传染性造血器官坏死病病毒 ( Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV ) , 属弹状病毒科 ( Novirhabdovirus ) , 的粒弹状病毒属 同属的水生动 物病毒还有病毒性出血性败血症病毒 ( Viral haemorrhagic septicaemia , VHSV ) 、 牙鲆弹状病毒 ( Hirame rhabdovirus, HRV) 和鳢弹状病毒 ( Snakehead Rhabdovirus, SRV) 。IHNV 是该属的代表种, IHNV 的代 1392 ) 。病毒粒 表株是 WRAC 株( ATCC 编码为 VR子形态为弹状, 直径约 80 ~ 90 nm, 长度为 160 ~ 180

禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定

禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定
Mammalian expression and identification of avian metapneu movirus subgroup C nucleocapsid protein
LI Zixuan1,2,WEI Li 2,WANG Jing2,ZHU Shanshan2,ZHANG Chunyan2,LIU Shuhang1, QUAN Rong2,YAN Xu2,CHEN Wu1,LIU Jue2*
收 稿 日 期 :2014-05-12; 网 络 出 版 时 间 :2014-05-30 20:22 基金项目:பைடு நூலகம்家现代农业产业技术体系 (CARS-42) 作者简介:李子璇 (1988-),女,硕士研究生,主要动物病毒蛋白表达方面的研究,E-mail:x20632102@163.com,
1.4 pEGFP-C1-N 重 组 真 核 表 达 载 体 的 构 建 及 鉴 定 将 回 收 的 PCR 产 物 及 载 体 分 别 用 EcoRI和 XholI进 行 双 酶 切,将 酶 切 后 载 体 进 行 去 磷 酸 化 处 理,用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)试 剂盒对酶切产物 进 行 纯 化 回 收。 纯 化 回 收 的 pEG- FP-C1载体 与 PCR 片 段 以 1∶7 的 比 例 按 照 T4 DNA Ligase(Fermentas公 司)说 明 书 进 行 连 接,用 重组质粒转化大肠杆 菌 DH5(宿 主 菌。 挑 取 5~10 个菌 落 进 行 菌 液 PCR 鉴 定。 用 E.Z.N.A.Plas- mid Mini Kit(OMEGA 公司)试剂盒提取阳性克隆 质粒,进行 EcoRI和 XholI双酶切鉴定。 1.5 转染 BHK-21细胞 用 PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Invitrogen)试剂盒 大 量 抽 提 细 胞 转 染 用 的 去 除 内 毒素的 重 组 质 粒 以 及 pEGFP-C1 载 体 质 粒。 得 到 的重组质 粒 及 对 照 组 pEGFP-C1 载 体 质 粒 的 浓 度 为2 326ng/μL 和 1 317ng/μL。 将 生 长 状 态 良 好

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位

po i P 0o H Vi f el h sl drc i n ou rsec sa IA)adWetr l nl rt nV 6 f D S9cl .T er ut o i i tmm uf oecneasy(F e R n s e s fn e l n s nbo aa— e t

要 : 了探讨兔 出血症病 毒( H V) 壳蛋 白的细胞 内定位 , 为 R D 衣 利用杆 状病毒 表达 系统 构建 了表达 R D H V
结构蛋 白( Po 的重组杆状病毒 。间接 免疫荧 光 (F 和 Wet nbo检 测以及 电子显 微镜观察 结果表 明 , v6) IA) s r lt e V6 P 0不仅能在 昆虫细胞 中正确表达 , 而且 能 自组装形成病毒样颗粒 ( L s 。进 一步对表达蛋 白进行 细胞 内 V P)
定位观察发现 , 表达蛋 白定 位于S9 f细胞 的细胞膜 上。 关键词 : 兔出血症病毒 ; 结构蛋 白; 昆虫一杆状病毒表达 系统 ; 细胞 内定位
中 图分 类 号 :8 2 6 ¥ 5 .5 文献标识码 : A 文 章编 号 :04—12 ( 00)2— 15—0 10 54 2 1 0 0 3 5
Exp e so n l c lz to n l ss o r s i n a d o a i a i n a a y i f VP6 o e n o b the r ha c d s 0 pr t i fRa bi mo r gi i— e s iu n i e tc l . c l v r x e so y t m a e vr s i ns c e l ba u o ius e pr s i n s s e s
t thr e me i sl eprc s( L s o di S9cl , n r e rsl f ofcl irsoyid— h e w r s r —k at l V P )f me f e s a df t r eu s noa m cocp i a t e e o vu i ie r n l u h toe n

应用杆状病毒表达系统有效表达PEDV_纤突蛋白

应用杆状病毒表达系统有效表达PEDV_纤突蛋白

山西农业科学2022,50(5):714-719Journal of Shanxi Agricultural Sciences doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.05.15doi应用杆状病毒表达系统有效表达PEDV纤突蛋白郝建伟1,薛春宜2,曹永长2(1.晋中学院生物科学与技术系,山西晋中030600;2.中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广东广州510006)摘要:为了解决猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异毒株纤突蛋白(S蛋白)分子质量大、难以表达的问题,研究采用Signal4.0软件预测S蛋白信号肽,构建表达替换信号肽S蛋白的重组质粒,鉴定正确后重组质粒转化DH10Bac感受态细胞并进行蓝白斑筛选,挑取白斑进行菌落PCR检测,检测无误后提取Bacmid DNA转染Sf9细胞,制备重组杆状病毒。

采用杆状病毒表达系统表达目的蛋白,采用免疫印迹法(West⁃ern blot)和串联式飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)技术鉴定表达蛋白,采用SDS-PAGE半定量方法测定蛋白含量;以Balb/c小鼠为材料进行免疫试验,应用中和试验、ELISPOT试验测定小鼠抗体滴度及细胞因子水平。

结果表明,S蛋白氨基端20个氨基酸为蛋白信号肽,重组质粒经双酶切鉴定构建成功,经菌体PCR检测验证表达骨架构建完成,转染Sf9细胞后获得重组病毒rB-PEDV-S;重组病毒表达蛋白经Western-blot和MALDI-TOF-TOF鉴定为目的蛋白,蛋白质量浓度可达0.0086μg/μL;替换原有信号肽可有效提高S蛋白产量,以0.86μg/只剂量免疫小鼠后,可刺激小鼠产生IL-4,但血清抗体水平与PBS组无明显差异。

替换信号肽有助于S蛋白表达,利用表达蛋白免疫小鼠可有效刺激IL-4产生。

关键词:猪流行性腹泻病毒(PEDV);杆状病毒;免疫印迹法;串联式飞行时间质谱;蛋白表达;疫苗中图分类号:S858.28文献标识码:A文章编号:1002‒2481(2022)05‒0714‒06Effective Expression of Spike Protein of PEDV with Expression System of Bac-to-BacHAO Jianwei1,XUE Chunyi2,CAO Yongchang2(1.Department of Biological Science and Technology,Jinzhong University,Jinzhong030600,China;2.School of Life Sciences,State Key Laboratory of Biocontrol,Sun Yat-sen University,Guangzhou510006,China)Abstract:In order to solve the problem of large molecular weight and difficult expression of spike protein(S protein)of the mutant strain of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV),in this study,the S protein signal peptide was predicted by Signal software(Version4.0),and the recombinant plasmid expressing the replacement of signal peptide S protein was constructed. Then the recombinant plasmid was transfected into DH10bac competent cells after identification,the white-blue plaque selection tests were conducted,and white spots were selected for further colony PCR detection.After the detection was confirmed,the Bacmid DNA was extracted and transfected into Sf9cells to prepare recombinant baculovirus.The target protein was expressed by baculovirus expression system and the expressed protein was identified by Western blot and MALDI-TOF-TOF methods The protein content was determined by SDS-PAGE semi quantitative method.Balb/c mice were used for immune experiment. The neutralization experiment and ELISPOT experiment were to determine the antibody titer and cytokine level.The results showed that the20amino acids in the amino terminal of S protein were protein signal peptides.The recombinant plasmid was successfully constructed through identification by double enzyme digestion.The bacteria PCR detection confirmed that the construction of the expression skeleton was completed,then,the recombinant virus rB-PEDV-S was obtained after transfected into Sf9cells.The protein expressed by the recombinant virus was identified as the target protein by verification of Western blot and MALDI-TOF-TOF,and the protein concentration was0.0086μg/μL,which showed that replacing the original signal peptide would effectively increase the yield of S protein.Immunization of mice by the S protein with the dosage of0.86μg/mice could stimulate mice to produce IL-4,but there was no significant differences between serum antibody level and that in PBS groups.The results proved that replacement of signal peptide contributed to the expression of S protein,and immunization of mice with the expressed protein could effectively stimulate production of IL-4.Key words:Porcine epidemic diarrhea(PEDV);baculovirus;Western-blot;MALDI-TOF-TOF;expression of protein;收稿日期:2021-12-15基金项目:“十三五”重点研发计划项目(2016YFD0500101)作者简介:郝建伟(1983-),男,山西大同人,高级兽医师,博士,主要从事动物病毒学研究工作。

传染性造血器官坏死病毒(IHNV)研究进展

传染性造血器官坏死病毒(IHNV)研究进展

传染性造血器官坏死病毒(IHNV)研究进展摘要对IHNV的特点、发病症状及流行特点进行了简单的概述,详细归纳总结了IHNV的检测技术、宿主对IHNV的防御机制以及具体防治措施,同时对IHNV未来的防治发展方向进行了展望,以期更好地控制IHNV引起的鱼类流行病的发生。

Abstract The characteristics,symptoms and epidemic characteristics of IHNV were surveyed,the diagnosis of IHNV,defense mechanism and control measures of host were summarized.Meanwhile,developing direction of control methods of IHNV in the future were expected in order to better control the epidemic of fish caused by IHNV.Key words IHNV;biological characteristics;epidemic characteristics;diagnosis;control传染性造血器官坏死病毒(Infectious Hematopoietic Nec-rosis Virus,IHNV),隶属于弹状病毒科诺拉弹状病毒属,是传染性造血器官坏死病(Infectious Hematopoietic Necrosis,IHN)的病原体。

IHN是鲑鳟鱼类的一种严重的急性、传染性病毒病[1],根据鱼的种类、年龄、病毒株系以及环境条件的不同,IHN 的爆发可能导致鱼体80%~100%的死亡率[2],对世界鲑鱼养殖业造成了重大损失。

目前已成为制约鲑鱼养殖发展的重要威胁,由于其发病急、发病率高,已被国际兽医局OIE(Office International Des Epizooties)列为必须申报的疾病,被我国列为二类疫病。

杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性

杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性

应用与环境生物学报 2008,14 ( 6 ): 787~792Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2008-12-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2008.00787杆状病毒是一类专一感染节肢动物(主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫)的病原微生物[1]. 杆状病毒的感染具有宿主特异性,而且它们对人、畜以及其他脊椎动物无害,所以早在1973年就被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐作为化学农药的理想替代品. 到目前为止,全球已有数十种杆状病毒被开发为商品杀虫剂. 在我国,已发现200多株昆虫杆状病毒,有20多种杆状病毒被研制成杀虫剂,并先后进入大田应用实验和商业化生产. 其中应用面积较大的有棉铃虫核型多角体病毒、斜纹夜蛾核型多角体病毒、茶毛虫核型多角体病毒和甜菜夜蛾核型多角体病毒等[2]. 昆虫病毒杀虫剂已成为国内外生物农药研究和开发十分活跃的领域之一.杆状病毒的典型结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的包涵体中. 根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(����������������������������������������,�PV)和颗粒体病毒属(������������������������,�V),它们的包涵体基质蛋白分别为�PV 的多角体蛋白(P���������)P���������)或�V 的颗粒体蛋白(��������).��������). 包涵体蛋白在不同的杆状病毒中具有高度保守性[3],但多角体蛋白与颗粒体蛋白之间在氨基酸序列的保守程度上要明显低于多角体蛋白之间或颗粒体蛋白之间的保守程度[4, 5]. 刘子夜等根据杆状病毒包涵体蛋白的高度保守性,推测不同来源的包涵体蛋白间可能广泛存在血清学交叉反应[6]. 如果杆状病毒包涵体蛋白间普遍存在共同抗原性,将为利用免疫层析检测技术快速检测不同种类杆状病毒的浓度提供可能性.为了研究不同杆状病毒的包涵体蛋白(特别是高度保守区)之间是否具有共同抗原性,本文选择了棉铃虫核型多角体病毒(Heliocoverpa armigera ��������������������, H��PV)多角体蛋白的两个高度保守区,检测了它们与多种杆状病毒包涵体蛋白之间的血清学交叉反应,为研制检测不同病毒杀杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性*刘彩云 刘金瑾 汤显春 张忠信 彭辉银 孙修炼**(中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室 武汉 430071)Occlusion Body Proteins of Baculoviruses Sharing Common Epitopes *LIU C�����, LIU J��j��, TA�� X�������, ZHA�� Z���gx��, PE�� H����� & SU� X������**(State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, W���� 430071, C����)Abstract �������������g������������������������������������������������������� �� ��� ���g�������g����� ��� ��� ��������� ����� ���� ��������� ��� ������������������������37�������������,��������� ���� �������� ��� 37 �������������,�������������, �w� ��g��� ��������� ��g���� ����g ��� ��������w���������.T�����������������������g���������w���g�������������������� w��� ������. T�� ���������� ���������� �g����� ��� �w� ��g��� ��������� �������� (54-113�� ��� 206-245��) ��� ���������� ��� Heliocoverpa armigera �������������������� (H��PV) w��� ������. T�� ������g���� ������������� ���w��� ��� �w� �������� ��� ��� ��������� ���� �������� ��� ����� ����������� w��� �������g���� �� ����g W������ �������g. T�� ������� �������� ���� ���� ��� ��� �w� �������� ��� H��PV ���������� w�� ���� �� �� �������z�� w��� ���� ��� ��� ��������������14�������������������������g�����������5g�������������,���������g ��������������������������� ��� 14 ���������������������� ��� g�������� ��� 5 g�������������, ���������g ���� ��� ��������� ���� �������� ��� ����������� ������������� ������ ������ ��������. F����������, ��� ������������ ��� ���������g � ��������� ���� ������������� ��� ��� ��������� ���� �������������� �� ����� ���������� �� ����g C�������� ���� S������ �� ��������� ����� �� ��� ������� ��������� �� ���� �����. F�g 7, R��� 9Keywords �����������; Heliocoverpa armigera ��������������������; ��������� ���� �������; ��g�������������������;��g��� ��������� �������;W������ ����; ������������������� �������CLC S476.13 : Q936收稿日期:2007-11-01 2007-11-01 修回日期: 2007-12-20*国家“863”计划项目(2006AA10A210)2006AA10A210)和中国科学院知识创新工程重要方向项目资助 S�������� �� ��� “863” P��j��� ����� M������� ��� S������ & T�������g� ��� C���� (2006AA10A210) ��� ��� K��w���g� I��������� P��g��� ��� ��� C������ A������ ��� S������� (����� ��. KSCX2-YW-�-040) **通讯作者 C�����������g ������ (E-����: ���x�@w�.���.��)摘 要 在比对已公布的37种杆状病毒包涵体蛋白氨基酸序列的基础上,选定棉铃虫核型多角体病毒(H��PV)H��PV)多角体蛋白的两个高度保守多肽(54-113��54-113��和206-245��)制备多克隆抗体,用W������ ����法检测这两个高度保守多肽与多种杆状病毒包涵体蛋白之间的血清学关系. 结果表明,H��PV 多角体蛋白的两个多肽的抗体与14种核型多角体病毒的多角体蛋白和5种颗粒体病毒的颗粒体蛋白均有明显的杂交信号,表明杆状病毒的包涵体蛋白之间具有共同的抗原决定簇. 根据杆状病毒包涵体蛋白之间的这种血清学关系,进一步讨论了利用免疫金试纸技术检测病毒杀虫剂中包涵体含量的可行性. 图7 参9关键词��� 杆状病毒;棉铃虫核型多角体病毒;包涵体蛋白;保守多肽;W������ ����;共同抗原性CLC S476.13 : Q93678814 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol虫剂中包涵体浓度的免疫金试纸提供依据.1 材料与方法1.1 病 毒棉铃虫核多角体病毒(H. armigera �PV,H��PV),栗黄卷叶蛾核多角体病毒(Trabala vishwou �PV,T��PV),甘兰夜蛾核多角体病毒(Mamestra brassicae �PV,M��PV),斜纹刺蛾核多角体病毒(Oxypla ochracea �PV,O��PV),黄褐天幕毛虫核多角体病毒(Malacosoma meustria testacea �PV,M���PV),茶尺蠖核多角体病毒(Ectropis obliqua hypulina�PV,E���PV),柳天蚕蛾核多角体病毒(Actias selene �PV,A��PV),蓖麻蚕核多角体病毒(Philosamia cynthia ricina�PV,P���PV),木撩尺蠖核多角体病毒(Culcula panterinaris�PV,C��PV),美国白蛾核多角体病毒(Hyphan cunea �PV,H��PV),舞毒蛾核多角体病毒(Lymantria dispar�PV,L��PV),苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica�PV,A��PV),甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua�PV,S��PV),灰茶尺蠖核多角体病毒(Ectropis grisescens�PV,Eg�PV),苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella �V,C��V),黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum �V,A��V),小菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae �V,P��V) (新疆株),褐边绿刺蛾颗粒体病毒(Parasa consocia �V,P��V),小菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae �V,P��V) (北京株). 以上病毒均由中国科学院武汉病毒研究所病毒保藏中心提供.1.2 杆状病毒包涵体蛋白氨基酸分析用M�gA��g�对28种已公布的核型多角体病毒多角体蛋白和9种颗粒体病毒颗粒体蛋白的氨基酸序列进行序列比对,发现两个区域的保守性非常高,推测可能是杆状病毒的共同抗原区. 为了研究杆状病毒包涵体蛋白间的共同抗原性,我们选定了H��PV多角体蛋白的这两个高度保守区��1(54-113��)和��2 (206-245��) (图1单下划线部分和双下划线部分)进行了原核表达.1.3 病毒包涵体蛋白的提取�纯化的包涵体悬液70℃保温2 �,用终浓度0.1 ���/L��2CO3,0.17 ���/L ��C�,0.001 ���/L EDTA (�H 11.0)的碱解液冰浴作用5~10 ���,稀醋酸调至�H 7.8~8.5,12 000 × g离心30 ���,取上清,保存于–20 ℃[7].1.4 H��PV多角体蛋白基因保守区��1、��2的克隆与原核表达根据H��PV多角体蛋白基因序列设计引物,扩增高保守区基因片段��1和��2,并分别克隆至�MD18-T载体(T�K���)T�K���),获得重组质粒�MD18-T-��1和�MD18-T-��2,再分别用Eco R/ Sal和Sal/XhoⅠ双酶切重组质粒,将目的片段亚克隆至原核表达载体�ET-28�,获得重组质粒�ET-28�-��1和�ET-28�-��2. 重组质粒均经酶切、测序鉴定正确后,分别转入E. coli �L21,在含100 μg/mL卡那霉素的L�培养液中37℃培养过夜,按1 : 100放大培养至D = 0.6~0.7时,加IPT�至终浓度1 ����/L,30℃诱导6 �,SDS-PA�E检测表达产物,分别命名为PH1和PH2.1.5 细胞破碎与蛋白纯化收集诱导表达的菌液,5 000 × g离心10 ���,弃上清,适量P�S重悬后超声破碎,12 000 × g离心10 ���,沉淀用洗涤液(2���/L2 ���/L尿素,50 ����/L T���,1 ����/L EDTA)洗涤2~3次,12 000 × g离心10 ���,包涵体沉淀参照����g��公司H��•���� K��产品说明采用H��纯化树脂纯化目的蛋白.1.6 抗H��PV多角体蛋白高保守区多克隆抗体的制备纯化的目的蛋白PH1常规方法免疫小鼠,制备鼠抗PH1抗血清;目的蛋白PH2常规方法免疫家兔,制备兔抗PH2抗血清. 实验兔、鼠的饲养,抗原注射和采血均委托中国科学院武汉病毒所实验动物中心进行.1.7 W������法检测包涵体蛋白之间的血清学关系提取的各病毒包涵体蛋白约1 μg经SDS-PA�E电泳后,电转移到PVDF膜上,5%封闭液(T�S��5%T�S �� 5%脱脂奶粉) 44℃封闭过夜. T�S-TT�S-T缓冲液(50 ����/L T���-C�,200 ����/L ��C�,0.1% Tw���-20,�H 7.5)室温洗膜5 ���. 抗PH1、PH2的抗血清用0.5%封闭液稀释1 000倍,将膜分浸入抗血清稀释液中,37℃温浴1 �. T�S-T缓冲液洗膜3次,每次10 ���. 二抗分别为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠Ig�和羊抗兔Ig�,用0.5%封闭液稀释3 000倍. 将膜浸入二抗稀释液中,37℃温浴1 �. T�S-T缓冲液洗膜4次,每次10 ���. 显色操作参照说明书进行.为了检测PH11和PH22在空间上是否互相影响对方与其抗血清相结合,我们进行了另一组实验. (1)1) 先用兔抗PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后,再用鼠抗PH11抗血清杂交,二抗用碱性磷酸酶标记的羊抗鼠Ig�;(2)2) 先用鼠抗PH11抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后,再用兔抗PH22抗血清杂交,二抗用碱性磷酸酶标记的羊抗兔Ig�.2 结 果2.1 包涵体蛋白氨基酸分析与高度保守区的确定用计算机软件(M�gA��g�)比对了H��PV与A��PV等37种杆状病毒多角体蛋白和颗粒体蛋白氨基酸序列的同源性. 结果发现,除Neodiprion sertifer �PV (47.8%)、N. lecontei �PV (47%)外,H��PV多角体蛋白与其他25种�PV多角体蛋白的同源性均在80%以上,而与�V颗粒体蛋白的同源性在52%~55.5%之间. 同时,还发现杆状病毒包涵体蛋白中存在两个高度保守区��1和��2 (图1),其区域同源性明显高于其它部分,多角体蛋白��1区的同源性在90%以上,颗粒体蛋白��1区的同源性在70%左右;而多角体蛋白��2区的同源性在85%左右,颗粒体蛋白��2区的同源性也高达75%. 推测这两个高度保守区很可能是杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原区. 本实验以棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白高保守区��1 (54-113��)和��2 (206-245��)为对象,研究杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性.1.2 目的基因的克隆与原核表达载体的构建PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,扩增片段大小与设计的��1、��2片段长度相符(图2). 切胶回收后的��1、��2片段克隆至�MD18-T载体获得的重组质粒经酶切鉴定均能获得与��1、��2大小相符的插入片段(图3),而后将插入片段亚克隆至原核表达载体�ET-28�,经酶切、序列测定证明原核表达质粒�ET-28�-��1,�ET-28�-��2构建正确.789 6 期刘彩云等:杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性图1 杆状病毒包涵体蛋白氨基酸序列的比对��������� ���� �������� ��� ��������������������������F�g. 1 A��g��� ����� ���� ��������� ��� ������������������������用C������ W比对氨基酸序列并用����D��显示. 黑色阴影()表示100%%氨基酸残基保守性,中等灰度阴影()表示80%或更高的氨基酸残基保守性,轻度灰色阴影()表示60%~80%的氨基酸残基保守性. 高度保守区��1和��2分别用单下划线和双下划线标明T�� ����� ���� ��������� w��� ���g��� �� C������ W ��� ��������� ����g ����D�� �����w���. ����k ������g () ��������� 100% ��������� ����� ���� ��������, ������ g��� ������g () ��������� 80% �� g������ ������������ ��� ��g�� g��� ������g () ��������� 60%~80 % ������������. T�� ��g��� ��������� ��g�����1 �� ���������� ��� ��2 �� ������ ����������79014 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol1.3 目的蛋白的原核表达与纯化将克隆正确的重组质粒�ET-28�-��1和�ET-28�-��2分别转化E. coli �L21,进行IPT�诱导表达. PH1PH1融合蛋白预测相对分子量M�=13 000,原核表达后SDS-PA�E分析显示在M�13 000左右处有一条明显的诱导条带. 收集诱导表达的菌液,细胞破碎后的上清和沉淀SDS-PA�E分析显示目的蛋白PH1图2 H��PV ��1和��2 PCR产物的鉴定Fig. 2�������i�����i�����������������������������1��2������gm����������i�����i�� ��� ���� ��������� ��� H��PV�����2����g�����H��PV ��1 ��� ��2 ����g�����1, ��1; 2, ��2; M, D�A ���k��图3 重组质粒�MD18-T-��1和�MD18-T-��2酶切鉴定Fig. 3 ����i�����i�� ��� ����mbi���� �l���mi��� �MD18-T-��1��� �MD18-T-��2 �� RE�1, �MD18-T-��1; 2, �MD18-T-��2; M, D�A ���k��图4 H��PV PH1蛋白原核表达与纯化的SDS-PA�E分析F�g. 4 SDS-PA�E �������� ��� H��PV PH1 ������� �x������� �� E. coliM, 蛋白分子量标准; 1, 未诱导表达; 2~4, IPT�诱导表达后2 �, 4 �, 6 �;5,; 5, 破碎后上清液��6��破碎后的包涵体��7��纯化蛋白��1�� 6�� 破碎后的包涵体���� 7�� 纯化蛋白��1��1M, P������ ��������� w��g�� ���k�� ; 1, U�������� �x��������; 2~4, I�������x����������IPT�������2�,4�,6�;5,S��������������������������I������ �x�������� �� IPT� ������ 2 �, 4 �, 6 �; 5, S���������� ������ ����������; 6, I�������� ������ ����������; 7, ���i���� �����i� ��1图5 H��PV PH2H��PV PH2蛋白原核表达与纯化的SDS-PA�E分析F�g. 5 SDS-PA�E �������� ��� H��PV PH2 ������� �x������� �� E. coliM, 蛋白分子量标准; 1, 未诱导表达; 2~4, IPT�诱导表达后2 �, 4 �, 6 �; 5~7,7, 纯化蛋白PH2M, �����i� m�l���l�� w�ig�� m��k��; 1, U�i������ �x�������i��; 2��~4, ������� �x�������i�� by ��TG ������ 2�� �, 4 �, 6 �; 5~7,���i���������i���2��7, ���i���� �����i� ��2��7916 期刘彩云等:杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性主要以包涵体形式表达,而可溶性的上清中并无明显的蛋白带,采用H��纯化树脂(����g��)纯化目的蛋白(图4). PH2融合蛋白预测相对分子量M �=10 000,原核表达后SDS-PA�E 分析显示诱导条带的大小与预测相符,采用H��纯化树脂纯化目的蛋白PH2(2 (图5).1.4 多克隆抗体的制备与检测从超声破碎的沉淀中纯化的目的蛋白常规方法分别免疫家鼠、家兔,获得鼠抗PH11抗血清和兔抗PH22抗血清. 多克隆抗体与原核表达产物的杂交结果显示,抗体效价约为1:1000 (图6).1.5 W������ ����检测PH1、PH2与其它包涵体蛋白之间的血清学关系提取的各杆状病毒包涵体蛋白经SDS-PA�E 电泳后,电转移到PVDF 膜上,分别以PH1和PH22抗血清为一抗,进行W������ ����分析,检测H��PV 多角体蛋白与其他包涵体蛋白的交叉反应. 而后分别先用兔抗PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后再用鼠抗PH11抗血清杂交,或者先用鼠抗PH11抗血清封闭后再用兔抗PH22抗血清杂交.结果显示,H��PV 多角体蛋白的高保守区PH11的抗血清与其他14种�PV 的多角体蛋白和5种�V 的颗粒体蛋白均有较为明显的免疫反应,且与�PV 多角体蛋白的反应略强于与�V 颗粒体蛋白的反应(图7-A).A). 另一个高保守区PH22也有相同的结果(图7-C).C). 同时,无论先用PH11抗血清还是先用PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后再用另一抗血清杂交,与直接用一种抗血清杂交的结果并无明显差异(图7-��,图7-D)D),这一结果表明,H��PV 的这两个高度保守区在空间上并不影响对方与各自抗血清的结合,这为下一步将利用PH11和PH22抗血清制备检测包涵体蛋白的免疫金试纸提供了可能性.3 讨 论本文在比对了H��PV 与A��PV 等37种杆状病毒多角体蛋白和颗粒体蛋白的氨基酸序列的基础上,制备了H��PV 多角体蛋白在杆状病毒中高度保守的两个片段的多克隆抗体,免疫学反应显示H��PV 多角体蛋白与多种�PV 的多角体蛋白和�V 的颗粒体蛋白之间具有明显的交叉反应,因此杆状病毒包涵体之间可能具有相同的抗原决定簇,普遍存在共同抗原性. 同时,杂交信号的强弱表明,H��PV 多角体蛋白与核型多角体病毒多角体蛋白间的血清学关系比与颗粒体病毒颗粒体蛋白间的血清学关系更为密切,此结果与孙国勋等[8]的研究结果相一致. 另外,我们的结果还表明,无论先用PH11抗血清还是先用PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后,再用另一抗血清杂交,结果并无明显差异,说明这两个共同图6 H��PV PH1, PH2蛋白的W������-����检测F�g. 6 W������ ���� �������� ��� H��PV PH1, PH2 ��������M: 预染蛋白分子量标准 P��������� ������� ��������� w��g�� ��������. 1: PH1 �������; 2: PH2 �������图7 H��PV 多角体蛋白与其它杆状病毒包涵体蛋白的w������-����分析F�g. 7 W������ ���� �������� ��� ��� ������g���� ������������ ���w��� H��PV ���������� ��� ����� ��������� ���� ��������A. 鼠抗PH1抗血清为一抗; �. 先用兔抗PH2抗血清封闭位点后再用鼠抗PH1抗血清杂交; C. 兔抗PH2抗血清为一抗; D. 先用鼠抗PH1抗血清封闭位点后再用兔抗PH2抗血清杂交A. H������z�� w��� ��� ����-PH1 ���������; �. H������z�� w��� ��� ����-PH1 ��������� ������ ����k��g ������������g ����� w��� ������ ����-PH2 ���������; C. H������z�� w��� ������ ����-PH2 ���������; D. H������z�� w��� ������ ����-PH2 ��������� ������ ����k��g ������������g ����� w��� ��� ����-PH1 ���������1. T��PV;2. M��PV;3. O��PV;4. M���PV;5. E���PV;6. A��PV;7. P���PV;8. C��PV;9. H��PV; 10. H��PV; 11. L��PV; 12. A��PV; 13. S��PV; 14. Eg�PV. 15. C��V; 16. A��V; 17. P��V (X��j���g ������); 18. P��V; 19. P��V (���j��g ������)P��V (���j��g ������)79214 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol抗原区在空间上并不相互影响对方的抗原性. 这些结果为利用这两个抗体制备免疫层析检测试纸提供了可能性.通常病毒杀虫剂质量检测的方法包括生物活性测定和多角体计数. 因为生物活性测定的周期较长,且取样的数量有限,所以对病毒杀虫剂产品中的多角体进行计数是更为常用的方法. 但是,由于未提纯的多角体病毒具有更好光保护性能以及更低的成本等原因,目前病毒杀虫剂产品多以病死虫尸直接匀浆后再加其它辅剂配制而成,这就使得用血球计数板对产品中多角体直接计数变得十分困难[9]. 基于本研究发现的杆状病毒包涵体之间普遍存在的共同抗原性,我们的下一步工作将以鼠抗PH11抗血清和兔抗PH22抗血清为材料,采用双抗体夹心免疫层析技术,研制检测包涵体蛋白浓度的免疫层析检测试纸,以期快速(半)定量的检测不同种类杆状病毒的浓度. 采用此试纸条对病毒杀虫剂中的多角体进行检测,具有操作方便、快速、实用的特点,具有推广应用价值.References1 ����k �C, ������� LA, D���k� PM, ���� IE. C����������z��������C����������z����� ��� ����������� ������������. I�: M����� LK ��.T�� �������������. ��w Y��k ��� L�����: P����� P����, 199719972 S�� XL (孙修炼), P��g HY (彭辉银). R����� �������� �� �����g����������� ��� ���� ������� �� ����g ������� �� C����. Virol Sin (中国病毒学),, 2007, 22: 158~1623 Z������ PM, K�����g �D, M������k JE. P����g������ ���������������������g �������������: E����������� ����� ��� ���� �����������. 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重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定

重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定

Vol.33高等学校化学学报No.112012年11月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2481~2485重组HEV 衣壳蛋白截短体的表达及鉴定李 霄1,2,屈勇刚2,3,贾 鹏2,4,刘立明2,5,季慧范1,2,赫东芸1,2,金宁一2,迟宝荣1(1.吉林大学第一临床医院,长春130021;2.军事医学科学院全军基因工程实验室,长春130122;3.石河子大学动物科技学院,石河子832000;4.深圳出入境检验检疫局,深圳518000;5.吉林农业科技学院动物医学学院,吉林132101)摘要 戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的肠道病毒性传染病.HEV 是一种无囊膜的单股正链RNA 病毒,其编码区由3个开放阅读框(ORF)组成,属戊型肝炎病毒科.HEV 衣壳蛋白由ORF2编码.本研究根据编码HEV ORF2aa382~aa674的核苷酸序列克隆了p293基因,并将其克隆入原核表达载体pET28a,利用大肠杆菌BL21(DE3)对HEV 衣壳蛋白截短体(p293)进行了表达.SDS⁃PAGE 和Western blot 检测结果表明,在优化的表达条件下(1mmol /L IPTG,250r /min,37℃,5h),重组蛋白p293能够在大肠杆菌内有效表达,目的蛋白约占总蛋白的66.15%.TEM 检测结果显示,原核表达的p293能够在体外形成约30~40nm 的病毒样颗粒.免疫印迹和免疫荧光检测结果表明,p293与HEV 标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性.实验结果表明,p293可应用于HEV 宿主吸附和病毒装配研究,为HEV 的预防与诊断研究奠定了基础.关键词 戊型肝炎病毒;衣壳蛋白;病毒样颗粒;原核表达中图分类号 O629;Q51;R373.2+1 文献标识码 A doi :10.7503/cjcu20120368收稿日期:2012⁃04⁃17.基金项目:国家自然科学基金项目(批准号:81072210,81101140)㊁ 重大新药创制”科技重大专项(批准号:2010ZX09401⁃305⁃14)和中国博士后科学基金(批准号:20100481057)资助.联系人简介:迟宝荣,女,教授,博士生导师,主要从事肝病分子生物学及消化道肿瘤研究.E⁃mail:chibr@ 戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是一种无囊膜的单股正链RNA 病毒,基因组全长约7.3kb [1].HEV 虽然只有1个血清型[2],但可分为5个基因型:Ⅰ型和Ⅱ型仅发现感染人,Ⅲ型和Ⅳ型为人畜共患,Ⅴ型仅发现感染禽类[3].HEV 首先发现于印度,随后出现在中东㊁远东㊁北非㊁西非㊁北美(墨西哥)㊁东南亚㊁中亚和中国等发展中及欠发达国家和地区[4~7].我国各省㊁市和自治区均存在HEV 感染病例,1986~1988年新疆发生HEV 大流行,持续近2年,病例近12万,死亡近千人[8].戊型肝炎(HE)作为人兽共患传染病,在家畜㊁经济动物和野生动物种群中流行的情况也比较普遍[9].总之,HEV 感染已成为世界各国不可忽视的公共卫生问题.HEV 编码区由3个互相重叠的开放阅读框(Open reading frame,ORF)组成(ORF1,ORF2和ORF3)[10].其中,ORF2是HEV 的主要结构蛋白,全长约2kb,编码由660个氨基酸组成的多肽(pORF2)[9].研究表明,pORF2不仅含有PA /PPP 切割位点等信号序列,且具有富含精氨酸(Arg)的序列(aa22~aa322).这些Arg 含量接近10%,等电点高达10.35的序列,在病毒衣壳蛋白组装基因组转录本的过程中,能够中和基因组RNA 负电荷,从而使pORF2具有典型的病毒衣壳蛋白特征[11].HEV 难以体外培养的问题一直困扰着研究者[12].利用基因工程手段人工表达病毒结构蛋白,并组装病毒样颗粒(Virus⁃like particle,VLP),可为HEV 研究提供替代方案,目前已有研究报道[13,14].以上研究均表明,HEV pORF2的部分序列确可形成强构象型表位,为HEV 的VLP 组装奠定理论基础.本文采用生物信息学方法筛选基因Ⅵ型HEV pORF2主要结构片段(aa382~aa674),并以质粒2842高等学校化学学报 Vol.33 pET28a为表达载体,以大肠杆菌(E.coli)BL21为表达宿主,对其表达后进行VLP组装.利用Western blot和透射电子显微镜(TEM)对表达产物和VLP进行了鉴定.制备了免疫血清,利用ELISA对表达产物进行了免疫原性测定,为建立HEV诊断方法和HEV致病机理研究奠定了基础.1 实验部分1.1 材料与仪器质粒pET28a㊁基因Ⅵ型HEV全基因组质粒pKS⁃HEV[9]㊁E.coli BL21(DE3)和人肝癌细胞HepG⁃2由本实验室保存;质粒pMD18⁃T㊁内切酶㊁Taq酶㊁连接酶㊁DNA marker和蛋白Marker购自大连宝生物公司;小鼠抗His⁃Tag单克隆抗体㊁AP标记的马抗鼠IgG和FITC标记羊抗鼠IgG购自Omiga公司; DMEM培养液和血清购自Hyclone公司;其它试剂均为国产分析纯.JEM⁃1200EXII型透射电子显微镜(Jeol公司);Himac CR21低温高速离心机(Hitachi公司);2720型PCR仪(ABI公司);BX51型荧光显微镜(Olympus公司).1.2 实验方法1.2.1 分子设计及引物合成 根据本实验室HEV全基因序列(Genbank:EF077630),参照文献[15, 16]的优化原则,结合InsightⅡ生物信息学软件对ORF2进行分析并设计引物.P1:5′⁃GCGAATTCAT⁃AGCACTTACCTTGTTCAACCTTGCTGAC⁃3′;P2:5′⁃GCGTCGACGAAGAATAAATCAATACTCCCGGG⁃3′.1.2.2 重组表达质粒构建 以pKS⁃HEV为模板,用引物P1和P2扩增编码HEV aa382~aa674基因片段并连接至pMD18⁃T载体上,得到重组质粒pMD293,测序;用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切pMD293,回收目的片段并与经同样酶切的pET28a载体连接,获得重组质粒pET293;重组质粒用Eco RⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,具体操作参照文献[17]方法进行.1.2.3 重组菌的IPTG诱导表达 pET293转化E.coli BL21,并于250r/min和37℃条件下培养至OD值为0.6~0.8.加入终深度为1mmol/L的IPTG,于250r/min和37℃条件下培养5h.于4℃以5000r/min转速离心20min收集菌体并进行超声破碎.产物于4℃,10000g条件下离心10min用于蛋白的初步纯化和复性[18],将表达产物命名为p293.1.2.4 Western blot 表达产物经SDS⁃PAGE分析后,电转移至硝酸纤维素膜,分别用小鼠抗His tag 单抗和碱性磷酸酶标记的马抗小鼠IgG单抗进行Western blot检测[19].1.2.5 蛋白的初步纯化和复性 用8~0mol/L脲素对表达产物进行梯度洗脱后加入终深度为1mmol/L的氧化型谷胱甘肽和2mmol/L的还原性谷胱甘肽,于4℃放置8~10h,用PBS缓冲液对产物进行透析并冻存于-20℃备用[15,16].1.2.6 重组蛋白的TEM观察 复性后的蛋白p293经2%磷钨酸(pH=7.0)负染,固定于喷炭的铜网上进行TEM观察[15].1.2.7 免疫荧光检测 制备单层HepG⁃2细胞,加入无血清DMEM细胞培养液(1mL/孔);分别加入50μg的蛋白p293或等量蛋白p293与抗HEV阳性血清混合液;分别用小鼠抗His tag单抗和FITC标记的羊抗鼠IgG单抗,以间接免疫荧光法对蛋白p293进行细胞结合活性检测[20].2 结果与讨论2.1 基因克隆与载体的构建和鉴定经PCR扩增到约903bp的目的基因,与预期结果相符;将目的基因克隆到pMD18⁃T载体,构建测序载体pMD293,经酶切鉴定后测序表明,所克隆目的基因序列未发生突变.将测序正确的目的基因片段克隆到pET28a载体,酶切鉴定结果表明获得了重组大肠杆菌表达质粒pET293(见图1).2.2 重组蛋白p293的SDS⁃PAGE和Western blot检测如图2所示,重组蛋白经SDS⁃PAGE分析,在33800处有明显的条带,与理论值相符,表明目的蛋白p293表达成功.凝胶扫描(图3)结果表明,重组蛋白p293占菌体总蛋白的66.15%.蛋白p293经Western blot检测得到大小约为33800的条带,与预期相符.Fig.1 Application of molecular simulation to explore the structure of CEA dsFv M:DL 2000DNA marker;lane 1:PCR product of the truncated capsid protein of HEV(aa382 aa674);lane 2:pMD293digested with EcoR Ⅰand Sal Ⅰ;lane 3:pMD293;lane 4:pET293digested with EcoR Ⅰand Sal Ⅰ;lane 5:pET293.Fig.2 SDS⁃PAGE assay of p293before (A )and after purification (B )and western blot assay ofthe p293after purification (C )M:low molecular weight protein marker;lane 1:p293induction in BL21(DE3)induced by 1mmol /L IPTG;lane 2:p293expressed in the inclusion body fraction;lane 3:SDS⁃PAGE assay of purified p293;lane 4:Western blot assay of purified p293.Fig.3 Gel scanning of p293after purificationFig.4 TEM image of recombinant proteinp293(20000×)2.3 重组蛋白p293的形态由负染的纯化后重组蛋白p293的TEM 照片(图4)可见直径约为30~40nm 的病毒衣壳样球形颗粒,表明重组蛋白p293可自组装形成病毒样颗粒.2.4 重组蛋白p293的细胞结合活性如图5所示,蛋白p293能与HepG⁃2细胞结合,并在细胞表面呈现特异性亮绿色荧光;经抗HEV 阳性血清处理的蛋白p293不能识别HepG⁃2细胞,未检测荧光颗粒,与未经处理的HepG⁃2细胞阴性对照一致.以上结果表明,p293可以特异性识别HepG⁃2细胞,并吸附于HepG⁃2细胞表面.3842 No.11 李 霄等:重组HEV 衣壳蛋白截短体的表达及鉴定4842高等学校化学学报 Vol.33 Fig.5 Identification of cellular binding activity of p293(100×)(A)p293mixed with anti⁃p293serum;(B)p293;(C)negative control.3 结 论基于HEV全基因组克隆,利用RT⁃PCR克隆了编码HEV ORF2aa382~aa674的核苷酸序列,构建了表达目的蛋白(p293)的原核表达载体pET293.利用原核表达系统在大肠杆菌中对蛋白p293进行了表达,并利用与蛋白p293融合表达的组氨酸标签对其进行了初步纯化.蛋白p293的SDS⁃PAGE分析结果表明,目的蛋白约33800,占菌体总蛋白的66.15%.Western blot检测结果显示,蛋白p293对HEV标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性.TEM测结果显示,蛋白p293在体外可以形成约30~40nm左右的病毒样颗粒,其颗粒大小和形态与HEV相似.在体外将蛋白p293以类似病毒感染的方式与HepG⁃2细胞作用,并进行免疫荧光检测,结果表明HepG2细胞表面出现了特异性亮绿色荧光颗粒,且此现象可被HEV标准阳性血清所抑制,证实蛋白p293可与HepG⁃2细胞发生特异性结合.本文结果表明,蛋白p293具有替代HEV进行感染机理等研究的可能,为建立HEV感染模型和HEV诊断方法奠定了基础.参 考 文 献[1] Osterman A.,Vizoso Pinto M.G.,Haase R.,Nitschko H.,Jäger S.,Sander M.,Motz M.,Mohn U.,Baiker A..Virol.J.[J],2012,9:28[2] Wedemeyer H.,Pischke S.,Manns M.P..Gastroenterology[J],2012,142(6):1388 1397[3] Teshale E.H.,Hu D.J..World J.Hepatol.[J],2011,3(12):285 291[4] PU Yun(浦昀),QI Yan⁃Fei(齐燕飞),XU Guo⁃Liang(徐国良),XU Hui(徐卉),ZHANG Shi⁃Yao(张士尧),MENG Ri⁃Zeng(孟日增),SONG Xiu⁃Ling(宋秀玲),YANG Huai⁃Ning(杨怀宁),LI Juan(李娟).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报) [J],2011,32(1):84 87[5] Nelson K.E.,Kmush B.,Labrique A.B..Expert.Rev.Anti.Infect.Ther.[J],2011,9(12):1133 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Ning⁃Shao(夏宁邵).Chin.J.Biotech.(生物工程学报)[J],2004,20(2):262 268 [15] LI Chang(李昌),WANG Hong(王宏),JING Ning⁃Yi(金宁一),JIN Hong⁃Tao(金洪涛),LIU Yu⁃Sheng(刘玉生),YU Fang(于芳),LI Zi⁃Jian(李子健),ZHANG Li⁃Shu(张立树).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2007,28(8):1493 1496[16] LI Xiao(李霄),JIN Ning⁃Yi(金宁一),LI Chang(李昌),TIAN Ming⁃Yao(田明尧),CHEN Lu(陈漉),JIA Peng(贾鹏),LIU Li⁃Ming(刘立明),LIU Yan(刘妍),GAO Peng(高鹏).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2009,30(4):682686[17] LI Chang(李昌),LI Xiao(李霄),LIU Yu⁃Sheng(刘玉生),YU Fang(于芳),HANG Jia⁃Li(韩佳丽),HU Bo(胡博),YE Ming(叶明),WANG Jing(王婧),DU Shou⁃Wen(杜寿文),JING Ning⁃Yi(金宁一).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2011,32(1):95 99[18] WANG Rui⁃Jian(王瑞俭),ZHENG Liang⁃Yu(郑良玉),YANG Xue⁃Ying(杨雪莹),YANG Ye(杨晔),WANG Xiao⁃Juan(王晓娟),CAO Shu⁃Gui(曹淑桂).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2011,32(12):2817 2822[19] Yang E.C.,Chi B.R.,Li X.,Liu Y.,Gao P.,Jia P.,Kan S.F.,Wen Z.M.,Wang W.,Jin N.Y..Chem.Res.Chinese Uni⁃versities[J],2010,26(2):235 239[20] He J..J.Viral.Hepat.[J],2006,13(12):840 844Expression and Characterization of a Recombinant Truncated Capsid Protein of Hepatitis E VirusLI Xiao 1,2,QU Yong⁃Gang 2,3,JIA Peng 2,4,LIU Li⁃Ming 2,5,JI Hui⁃Fan 1,2,HE Dong⁃Yun 1,2,JIN Ning⁃Yi 2,CHI Bao⁃Rong 1*(1.The First Hospital of Bethune Faculty of Medical Sciences ,Jilin University ,Changchun 130021,China ;boratory of Genetic Engineering of PLA ,Academy of Military Medical Sciences ,Changchun 130122,China ;3.College of Animal Science and Technology ,Shihezi University ,Shihezi 832000,China ;4.Shenzhen Entry⁃exit Inspection and Quarantine Bureau ,Shenzhen 518000,China ;5.College of Veterinary Medicine ,Jilin Academy of Agricultural Science and Technology ,Jilin 132101,China )Abstract Hepatitis E is an enterically transmitted viral disease caused by infection with hepatitis E virus (HEV).HEV is a nonenveloped virus classified in the family of Caliciviridae.The virus appears to be a poly⁃adenylated,positive⁃stranded RNA virus with three major open reading frames(ORFs).The capsid protein of HEV is encoded by the open reading frame 2(ORF2).We attempted to produce a truncated capsid protein,designed p293,in E.coli .The p293gene encoding amino acids aa382 aa674of HEV ORF2was designed based on the full length of HEV ORF2,cloned into the vector pET28a,and expressed in E.coli strain BL21(DE3).SDS⁃PAGE and Western blot analysis demonstrated that the recombinant protein p293could well ex⁃pressed in E.coli .Under optimized conditions (1mmol /L IPTG,250r /min,37℃,5h),the yield of soluble p293was approximately 66.15%of the total protein.It was observed,by transmission electron micros⁃copy,that p293expressed in E.coli formed 30 40nm viral⁃like particles.The experimental results also showed that p293reacted with HEV positive serum and had a good reactionogenicity.These results showed that the p293may has utility in the analysis of cell specific factors in the protein processing and assembly of HEV,and serve as useful antigen for both diagnostic and vaccine purposes.Keywords Hepatitis E virus(HEV);Capsid Protein;Viral⁃like particle(VLP);Prokaryotic expression(Ed.:H ,Z ,K )5842 No.11 李 霄等:重组HEV 衣壳蛋白截短体的表达及鉴定。

对虾病毒IHHNV衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心ELISA的高效检测

对虾病毒IHHNV衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心ELISA的高效检测

drome,RDS),也 是 南 美 白 对 虾 常 见 的 一 种 慢 性 致 病病毒.IHHNV主要感染对虾的表皮、鳃、前后肠上 皮细胞、神经索和神经节等外胚层组织;造血组织、 淋巴器官、性腺、结缔组织和横纹肌等中胚层器官, 感染对虾后可在宿主细胞核内形成一定的包涵体. 患此病的病虾身体变形,引起慢性感染为主,严重时 可造成虾的大量死亡,影响经济效益[811].
3期
于 衬,等:对虾病毒 IHHNV衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心 ELISA的高效检测
· 419·
药领域,尤其是检测试剂盒的开发为疾病的临床诊 断提供更多便利性和准确性.
由于缺乏对 IHHNV较敏感的对虾细胞系,关 于 IHHNV的侵入宿主机制以及在宿主体内的复制 机制研究较少,需要进行深入的研究,本研究用纯化 的多肽制备了 2种高效的特异性多克隆抗体,在原 核表达系统中成功表达了具有较好免疫原性的抗原 多肽,并成功建立了高效的检测对虾 IHHNV的新 型双抗体夹心 ELISA方法,对于 IHHNV病毒的早 期诊断提供有力的方法,有助于建立完善的对虾病 毒监控系统,对及时预 防 和 控 制 对 虾 病 毒 IHHNV 的爆发和流行具有重要意义.
传染性皮下及造血组织坏死病毒最初于 1981 年在美国夏威夷地区养殖细角滨对虾中被发现[2], 是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一,该病 毒在亚洲地区也具有流行趋势,IHHNV病毒从 2001 年就开始在中国养殖的凡纳滨对虾中普遍流行,并 对不同种对虾造成了一定的经济损 失[35].IHHNV 是单链 DNA细小病毒,属于细小病毒科,短浓核症 病毒属(Brevidensovirus),是目前已知的对虾病毒中 颗粒最小的一种,直径只有 22nm,无包膜,20面体 对称的球状 颗 粒 [67].IHHNV主 要 对 细 角 滨 对 虾 和 凡纳滨对虾比较敏感,尤其会严重危害幼虾,在自然 条件下对于 大 部 分 养 殖 对 虾,IHHNV均 可 以 感 染, 严重时引起对虾的发病和死亡;感染凡纳滨对虾后 可以造成慢性矮小残缺综合症 (runtdeformitysyn
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3期
谢三磊等: NV 核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定
37
IHNV 从最初只流行于北美洲和欧洲 的急剧增加, 1968 年随鱼卵从阿拉斯加传入日本北海 一些国家,
[2 ] [3 ] 道 。最近 IHNV 已 经 在 我 国 局 部 地 区 流 行 。 IHNV 病毒的基因组结构主要是由 3' 端非翻译前导
[8 - 9 ] [7 ]
菌株、 载体及细胞 pGMT 载体、 大肠杆菌 ( E. coli ) Top10 、 质粒抽 提试 剂 盒 购 自 北 京 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 ;
DH10Bac 感受 态、 CHSE ( 大 鳞 大 马 哈 鱼 胚 胎 细 胞 pFBLICBse 杆状病毒载体及 Sf9 昆虫细胞均 系) 、 由畜禽疫病防控技术北京市重点实验室提供 。 1. 2 主要试剂 199 / EBSS 培养基购自 Hyclone 公司; 胎牛血清 one step RNA PCR 购自 Gibco 公 司; PCR 试 剂 盒、 KIT( AMV) 和 T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司; 脂 SF900 II 培养 质体转染试剂 Celfectin Ⅱ Reagent、 基购于 Invitrogen 公司; RNA 提取试剂盒购自 Sigma His 单克隆抗体为 BD 公司产 公司; HRP 标记 anti品; ECL 显色液购自 Thermo 公司。 1. 3 引物设计 根 据 GenBank 中 登 录 的 IHNV 基 因 序 列 ( L40883 ) , N 用软件 Primer 5. 0 设计特异性 IHNV-
器官坏死病的高效、 新型的诊断试剂奠定物质基础。
1
1. 1
材料和方法
( Leader) 区﹑基因区﹑基因间连接区及 5' 端非转录 LeaderNM1拖尾( Trailer ) 区组成, 排列方式为 3'M2GNVLTrailer5'[4]。核衣壳蛋白 ( N ) 呈单链螺 旋状结构, 直径约为 16 nm, 周长约为 7. 5 nm, 大小 为 42 ~ 50 kDa。它是弹状病毒 5 个结构蛋白中较为 保守 的 一 个 蛋 白, 也 是 核 糖 核 蛋 白 复 合 体 ( Ribonudeoprotein complex , RNP ) 的 一 个 重 要 组 成 部 [5 ] [6 ] 分 。Thomas 等 在电镜下观察到蛋白中间区域 是和基因组 RNA 结合在一起的。 Said 等 研究表 明, 核衣壳蛋白和基因组 RNA 紧密结合形成一个螺 旋对称的结构作为 RNA 合成的模板, 其主要功能 是: 参与核衣壳的组装; 与基因组 RNA 一起作为转 录的模板保护 RNA 免受核酸酶的降解; 对转录和复 制有调节作用
[1 ] nm, 有囊膜 。随着水生动物及其产品进出口贸易
收稿日期: 2014 - 03 - 19 基金项目: 北京市农林科学院科技创新基金( CXJJ201316 ) 作者简介: 谢三磊( 1987 - ) , 男, 河南鄢陵人, 在读硕士, 主要从事病原微生物分子生物学与免疫学研究。 通讯作者: 孙惠玲( 1971 - ) , 女, 甘肃武威人, 副研究员, 博士, 主要从事动物传染病防控研究。
Expression and Identification of Nucleocapsid Protein of IHNV in Baculovirus Expression System
2 XIE Sanlei1, , WANG Wenhui1 , SUN Huiling2
( 1. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China) Abstract: To study the major structural nucleoprotein ( N ) of infectious hematopoietic necrosis virus ( IHNV ) by baculovirus systems, in this study nucleoprotein ( N) gene( 1 176 bp) was amplified by RTPCR from infectious hematopoietic necrosis virus ( IHNV) and inserted into the baculovirus vector pFBLICBse to construct a recombinant plasmid pFBLICBseN. The constructed recombinant transposition plasmid pFBLICBseN was transformed to competent E. coli DH10Bac to get recombinant bacmids rBacmidN. The obtained recombinant bacmid rBacmidN was transfected to insect Sf9 cells, and the recombinant baculovirus that contained N gene was obtained. IFA and Western Blot analysis showed that the recombinant N protein can be recognized by horseradish peroxidase ( HRP ) labeled histidine monoclonal antibody ( antiHis) which indicated IHNV N gene has been successfully expressed in Sf9 cells infected with recombinant baculovirus. The study laid a foundation of further study on N protein structure , function and immunological characteristics. Key words: Infectious hematopoietic necrosis virus; N gene; Recombinant baculovirus 传染性造血器官坏死病( Infectious haematopoietic necrosis, IHN ) 是鲑、 鳟鱼类的一种以造血组织 严重坏死、 显著贫血、 肝、 脾、 肾褪色为主要特征的传 染性疾病。不同种类鲑、 鳟鱼类对病原的易感性不 同。病原为传染性造血器官坏死病病毒 ( Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV ) , 属弹状病毒科 ( Novirhabdovirus ) , 的粒弹状病毒属 同属的水生动 物病毒还有病毒性出血性败血症病毒 ( Viral haemorrhagic septicaemia , VHSV ) 、 牙鲆弹状病毒 ( Hirame rhabdovirus, HRV) 和鳢弹状病毒 ( Snakehead Rhabdovirus, SRV) 。IHNV 是该属的代表种, IHNV 的代 1392 ) 。病毒粒 表株是 WRAC 株( ATCC 编码为 VR子形态为弹状, 直径约 80 ~ 90 nm, 长度为 160 ~ 180
2 9 ( 3 ) : 3 6 -4 0 华 北 农 学 报 ·2 0 1 4 ,
IHNV 核衣壳蛋Leabharlann 在杆状病毒表达系统中 的表达及鉴定
1, 2 1 2 谢三磊 , 王雯慧 , 孙惠玲 ( 1. 甘肃农业大学 动物医学院, 甘肃 兰州 730070; 2. 北京市农林科学院 畜牧兽医研究所, 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室, 北京 100097)
引物序列 引物序列( 5' - 3' ) Primer sequence F 5'GATGACAAGCGCACTCAGAGA3' R 5'GTGGAATGAGTCGGAGTCTCC3' 5'TATTCATACCGTCCCACCA3' 5'GGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAA3' F 5'TACTTCCAATCCATG GCCACCATGG GATGACAAGCGCACTCAGAGA3' R 5'TATCCACCTTTACTGGTGGAATGAGTCGGAGTCTCC3' F 5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG3' R 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGG3'
。 因此, 核衣壳蛋白是传染性造
血器官坏死病病毒的重要结构蛋白, 对其进行深入 的研究十分必要。 本试验以北京市某渔场病鱼组织内分离得到的 传染性造血器官坏死病病毒 BJLL 株为试验材料, LICBse 载体在 Sf9 昆虫细胞中表达重组 利用 pFBLICBse 载体在启动子下游带 核衣壳蛋白。此 pFBHis 鼠单克隆抗体进行 有 6 × His 标签, 便于用 anti验证。试验的开展为进一步研究传染性造血器官坏 死病病毒核衣壳蛋白的免疫功能, 研制传染性造血
PCR 方法从传染性造血器官坏死病病毒( IHNV) 中扩增 RNA 获得 1 176 bp 的核衣壳蛋白( N ) 基 摘要: 采用 RTLICBse 杆状病毒载体中, LICBseN, 因, 将其插入于 pFB构建了重组质粒 pFB转化至感受态细胞 DH10Bac 中, 获得 N。再将其转染至 Sf9 昆虫细胞, 重组杆粒 rBacmid获得重组杆状病毒。IFA 和 Western Blot 分析表明, 重组 N 蛋白可 His ) 识别, IHNV N 基因在昆虫细胞 Sf9 中获得了正确表 以被辣根过氧化物酶( HRP) 标记的组氨酸单抗( anti表明, 达。为深入研究 N 蛋白的功能和免疫学特性奠定了基础 。 关键词: 传染性造血器官坏死病病毒; 核衣壳蛋白基因; 重组杆状病毒 中图分类号: S432. 4 文献标识码: A 文章编号: 1000 - 7091 ( 2014 ) 03 - 0036 - 05
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