脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）
实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。
反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。
反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。
按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。
（8）另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色。
三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。
4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。
实验五 固定化脲酶活力的测定
实验五固定化脲酶活力的测定一、实验原理固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。
常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。
酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。
故可测定脲酶活力的大小。
二、仪器和试剂1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器2、实验四制备的固定化脲酶3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 ml4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶解并定容至100 ml。
此溶液含NH3为40 µM6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中，冷却后加水定容至1000 ml7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。
另称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮于棕色瓶中，密塞保存。
三、实验步骤1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。
取0.3-0.5 g，切碎。
2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水浴中保温5 min。
3、向3号管加入30℃预保温的3%尿素溶液1 ml，并准确开始计时；向1号管加蒸馏水1 ml，于30℃水浴中反应20 min（t），并不断振摇。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理，最终获得比活性分别为923.6U/g，780.1U/g，585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆，粉碎，以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉，再加入100ml（固液比1：10）的30%乙醇溶液，充分摇匀30min，放置冰箱保存24h后，以4000r/min离心15min，上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷（-20℃）的无水乙醇至终体积分数为10%，以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀，收集上清液；再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%，以15000r/min冷冻离心10min，弃去上清液，收集沉淀，立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液（pH6.8）中，4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－200 层析柱，酶本身不能进入凝胶颗粒，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液（pH=6.8）作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀，然后装柱，加样，控制流速，流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下，直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化，本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤，收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中，装量要均匀，然后进行冷冻处理，冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测，同时将产品低温保藏。
脲酶的制备及其生物学性质的研究
综合研究性实验三：脲酶的制备及其生物学性质的研究一.实验目的1.学习大豆脲酶的提取方法；2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法；3.测定脲酶的活力单位及此活力；4.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。
二.脲酶提取液的制备三.脲酶Km的测定[一]实验原理K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等研究中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：对于K m值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。
具体做法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。
具体反应如下：（1）酶促反应（2）呈色反应[二]实验试剂1.0.05mol/L尿素溶液2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液3.10%ZnSO4溶液4.0.5mol/LNaOH溶液5.10%酒石酸钾钠溶液6.钠氏试剂将碘化钾75g，碘55g，蒸馏水50mL以及汞75g，置于500mL锥形瓶内，用力振荡约15min，待碘色消失时，溶液即发生高热。
将锥形瓶浸在冷水中继续摇荡，一直到溶液呈绿色时止。
将上清液倾入1000mL量筒内，并用蒸馏水洗涤残渣，将洗涤液也倾入量筒中，最后加蒸馏水至1000mL，此即为母液。
豆浆中脲酶活性的测定
表 ２ 准确 度试验 （ 一３ ｎ ）
０ ９９ ） ． ９２ 。结 果表 明 ： 豆 甙在 ０ ０ ２ ． ３ｍｇ ｍｌ 大 ． ０ ￣０ ０ ０ ／ 范 围 内呈 良好 的 线 性 关 系 ， 低 检 出 限 为 ０ ０ｔ ； 最 ．４ｔ ｇ 淫 羊 藿甙 在 ０ ０ ２ ０ １ｍｇ ｍｌ 围 内呈 良好 的线 ．０ ￣ ． Ｏ ／ 范
维普资讯
江 苏预防医学 ２０ 年 ９月第 １ 卷第 ３ ０２ ３ 期
Ｊ ｎｓ ｒ ｄ Ｓｐ２ ０ ， ｌ ３Ｎ — ｉ ￣ｕＦｅ Ｍｅ ， ｅ ，０２Ｖｏ １ ， ｏ３ ａ ＇ｖ —．
பைடு நூலகம்
（ ＮＨ ４ ２ ３ ２ ａ Ｈ — ）ＣＯ ＋ Ｎ Ｏ
２ ２ Ｈ Ｏ
２ ５０ ２０ １）
【 文献 标识码】 Ｂ 【 中图分类号】 Ｒ一３ 【 ３ 文章编 号】 １ ０ －９ ７ （０ ２０ － ０ ６ －０ ０ ６ ００２０）３ ０ ３ ３ 【关 键 词 】 豆浆 ； 酶活性 ； 脲 吸光 度
豆浆营养丰富 ， 但必须煮沸后才可食用 。 煮沸可 防止豆浆 中毒 ， 但也破坏了多种营养物质 。 由于豆浆 有“ 假沸” 现象 ， 目前多以豆浆脲酶 活性来表示抗营
［］ 张 回剐 ， ３ 曾红 ， 徐绥绪 ， ． 效液 相色谱法测定糖脂双 降茶中 等 高 淫羊藿甙的含量 Ｅ］色谱 ，０１ １（）３５３６ Ｊ． ２０ ，９４ ：６—６．
－ １ ］ 王 德先 ， ４ 杨更 亮 ， 秀荣 等 ．毛 细管 电泳 法测 定 淫羊 藿甙 的 宋 ｐａ Ｋ 值及其在 中药淫羊藿 中的含量ｌ ］ 色谱 ，０ １ １ （ ） ６— －． Ｊ ２ ０ ，９ １ ：４
６６ ．
２ ５ 准确 度 试 验 ．
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理，最终获得比活性分别为923.6U/g，780.1U/g，585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆，粉碎，以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉，再加入100ml（固液比1：10）的30%乙醇溶液，充分摇匀30min，放置冰箱保存24h后，以4000r/min离心15min，上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷（-20℃）的无水乙醇至终体积分数为10%，以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀，收集上清液；再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%，以15000r/min冷冻离心10min，弃去上清液，收集沉淀，立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液（pH6.8）中，4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－200 层析柱，酶本身不能进入凝胶颗粒，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液（pH=6.8）作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀，然后装柱，加样，控制流速，流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下，直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化，本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤，收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中，装量要均匀，然后进行冷冻处理，冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测，同时将产品低温保藏。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验四脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)
一、实验原理
脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
反应式：
(NHO2CO+ HO ^脲酶＞2NH3 + CO2
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。
反应式：
NH・ F2O+ 2KHgl4 + 3KOH ■—HgO • HgNH + 7KI + 3H 20
(纳氏试剂) (碘化氨氧合汞)
二、实验步骤
将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：
取3支干净干燥试管，编号：1空白；2、标准；3、样品。
按下表步骤加入实验制备的酶液及试剂：
(7)从样品管加尿素开始计时，准确反应5min,立即向样品管(3号管)加1 mol -L HSQ 1.00mL，终止反应。
(8)另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色
(9)各管混匀后，30min内，用分光光度计测试:
比色记录A260nm A i A A3
三、结果计算
脲酶活力(U • mL -1) = ( A 3 - A 1 ) *标准管中的NH微摩尔数
(A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数
式中：n为酶样品的稀释倍数
四、仪器和试剂
1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。
4、磷酸盐缓冲液（pH7.0）: 6.70 g Na2HPO4 • 2 H2O , 3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5、 1 mol • L -1 HSQ溶液：56mL浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6、硫酸铵标准溶液：称取在60° C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL。
此溶液含NH3为40卩mol • mL-1。
7、纳氏试剂：分别溶解3.5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。
向此液中加70 mL30% KOH不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。
混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。
在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2 和7 g KI 于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。
过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。
（配置方法之二）。