大肠杆菌的λ-噬菌体
λ噬菌体的裂解性和溶原性
生命科学学院λ噬菌体的裂解性和溶原性的基因调控机制姓名：学号:班级：专业:摘要λ噬菌体（phage）有两种生存策略，一种通过感染宿主细胞，产生大量的子代噬菌体，同时宿主细胞裂解死亡，这种方式称为裂解性感染。
另一种是噬菌体的基因组以一种原噬菌体的方式潜伏于细菌中，这种增值方式称为溶原态（lysogeny）。
λ噬菌体的裂解发育、溶原发育和溶原发育到裂解发育的诱导是研究生物分子调节优异的模型。
经过四十多年的研究，在这个模型中已经发现了众多的正调节因子和负调节因子在转录水平或转录后调节基因的表达。
关键词:λ噬菌体、裂解性、溶原性目录1.摘要22.λ噬菌体的结构组成 32.1壳体结构 32.2λ噬菌体的核心33.λ噬菌体的生活周期 63.1 λ噬菌体DNA复制 63.2λ噬菌体的转录调控73.3λ噬菌体的溶原性感染93.3.1λ噬菌体溶原化状态的建立93.3.2λ噬菌体基因组的整合113.3.3原噬菌体的割离123.3.4裂解性-溶原性选择决定154.参考文献161951年 Esther Lederberg 发现E.coli K12菌株经UV诱发或偶尔自发放出噬菌体。
E.coli K12中有潜伏的、无感染能力状态的噬菌体，称原噬菌体。
将这种噬菌体命名为λ。
λ侵染 E.coli后可进入裂解周期（lytic cycle）或溶原周期（lysogeny）。
2.λ噬菌体的结构组成2.1壳体结构λ噬菌体是有尾噬菌体，壳体由头部和尾部组成，头部和尾部通过颈部相连。
头部通常呈二十面体对称，直径为60nm左右；尾部呈螺旋对称，无收缩性。
λ噬菌体头部蛋白主要有gpE(38kD)和gpD(12kD)，他们以非二硫键进行共价连接。
2.2λ噬菌体的核心λ噬菌体核心包含线状dsDNA，分子量为30.8MD，含有48502bp，其双链DNA的两5′端叫做m端, 末端碱基为G，为左向或反时针方向转录的链。
R链或右链5′端称为m′端，末端碱基为A。
噬菌体侵染大肠杆菌实验
将噬菌体与大肠杆菌混合 ，一定时间后观察噬菌体 的侵染情况。
通过离心去除未侵染的大 肠杆菌，洗涤以去除多余 的噬菌体。
在适宜条件下培养，观察 噬菌体的繁殖情况。
通过显微镜观察、计数等 方法检测实验结果。
实验操作注意事项
无菌操作
确保整个实验过程在无 菌条件下进行，以避免
污染。
精确测量
确保所有试剂的准确测 量，以保证实验结果的
04
结论与展望
实验结论
噬菌体侵染大肠杆菌实验证明了噬菌 体的存在和侵染机制。
实验结果证明了噬菌体的专一性，即 一种噬菌体只能侵染对应种类的细菌 。
通过实验观察到了噬菌体对大肠杆菌 的吸附、侵入、复制和释放过程。
实验的优缺点分析
优点
实验操作简单，结果直观，能够 很好地展示噬菌体的侵染过程。
缺点
实验过程中无法控制噬菌体的数 量和侵染时间，可能会影响实验 结果的准确性。
作为宿主细胞，用 于噬菌体的侵染。
缓冲液
用于维持实验过程 中的pH值稳定。
噬菌体
用于侵染大肠杆菌 的病毒。
培养基
用于培养大肠杆菌 。
其他试剂
如抗生素、染色剂 等。
实验方法与步骤
01
02
03
04
05
1. ห้องสมุดไป่ตู้备噬菌体和 2. 感染实验 宿主…
3. 离心与洗涤
4. 培养与观察
5. 结果检测
将噬菌体稀释至适当浓度 ，同时培养大肠杆菌至对 数生长期。
噬菌体的生命周期包括吸附、 注入核酸、复制和组装新噬菌 体等步骤。
噬菌体侵染大肠杆菌的过程
噬菌体通过识别大肠杆菌表面的受体 ，吸附到细菌表面。
噬菌体的核酸利用大肠杆菌的代谢系 统和基因表达机制进行复制。
微生物复习题
微生物复习题一、填空题1.革兰氏阳性细菌细胞壁的成分是肽聚糖和磷壁酸；革兰氏阴性细菌的细胞壁分内外两层，内层成分是肽聚糖，外层称外膜，成分是脂蛋白、脂多糖和磷脂。
2.耐高温微生物细胞膜中含有较多饱和脂肪酸，耐低温微生物细胞膜中则含有较多的不饱和脂肪酸。
3．菌毛多见于革兰氏阴性性致病菌中，它具有粘附功能。
4.酿酒酵母的细胞壁呈三明治状，外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间层为蛋白质。
5.单个病毒粒子称为病毒粒，它由核心和衣壳构成，有些较复杂病毒还有一层包膜，其上长有刺突等附属物。
6.大肠杆菌的λ噬菌体是一种常见的温和噬菌体，其头部呈球状，尾部特点为非收缩性且末端附着有细尾丝。
7．微生物生长需要合适的渗透压，如果环境渗透压过高，将引起质壁分离；而低渗透压的环境会造成细胞吸水膨胀。
渗透压的大小是由溶液中所含有的分子或离子的质点数所决定的，等重量的营养物质，其分子或离子越小，产生的渗透压越大。
8.巴斯德消毒法是基于结核杆菌的致死条件为62℃、15min而定的。
9．耐氧菌之所以能在有氧的环境中生存，而不被超氧阴离子自由基所毒害，原因是其细胞内存在有超氧化物歧化酶和过氧化物酶两种酶。
10．抗生素的作用机制有抑制细菌细胞壁合成、干扰细胞质膜、抑制蛋白质合成和抑制DNA复制和转录等。
11．吖啶类化合物和ICR化合物可导致基因发生移码突变。
12．与营养缺陷型有关的菌株有三种：①从自然界分离到的任何菌种的原始菌株称为野生型；②它经过诱变剂处理后所发生的丧失某酶合成能力的菌株称为营养缺陷型；③再经回复突变或重组后的菌株称为原养型。
13．普遍转导与局限转导主要区别在于：①普遍转导的噬菌体是完全缺点噬菌体，而局限转导的噬菌体是部分缺陷噬菌体；②普遍转导噬菌体能转移供体菌的任何基因，而局限转导噬菌体只能转移供体菌的部分特定基因。
14．携带F质粒的菌株称为 F+ 菌株；无F质粒的菌株称为 F-菌株；F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称为 Hfr菌株。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
细菌质粒性质：
5、质粒对于细菌的生长不是必须的
代表性细菌质粒（1）
F因子（fertility factor）
F因子，又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中 等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
★ 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型 （例如β 半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 ★ 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表 达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
缺点：
★ 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因 编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区 原核：CDNA 真核：DNA
划线到LB平板上。
质粒概述
质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子
不具有胞外期
对寄主细胞来说是非必需的 符合这三条标准的染色体外DNA或 RNA分子都可以称为质粒。 狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的 环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母p加2-3个 大写字母和数字，如pBV220，pET30 。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
郑丽舒
中国疾控中心 病毒病预防控制所
2015.04.15
主要内容
一、大肠杆菌：概述 应用 基本操作 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：λ噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆
大肠杆菌
大肠杆菌
中文名称： 外文名称： 大肠杆菌 Escherichia coli (Theodor Escherich 1885)
2022年新疆农业大学生物技术专业《微生物学》期末试卷A(有答案)
2022年新疆农业大学生物技术专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、磷壁酸是革兰氏______性细菌细胞壁上的特有成分，主要成分为______或______。
2、噬菌体的成斑率一般均大于______。
3、有六种发酵类型可经过EMP途径并由其终产物丙酮酸出发，即① ______，代表菌如______；② ______，代表菌如______；③ ______，代表菌如______；④ ______，代表菌如______；⑤ ______，代表菌如______；⑥ ______，代表菌如______。
4、光能有机营养型微生物的能源是______，氢供体是______，基本碳源是______和______，这类微生物的代表如______等。
5、菌物界中的菌物是指一大群______、______、______的真核微生物，一般包括______、______和______三类。
6、要加速发展我国的微生物学，应努力从以下几个方面人手： ______；______；______；______等。
7、在微生物的生产实践中，为获得优良接种体（“种子”），多取用______期的培养物；为获得大量菌体，多取用______期的培养物；为取得高产量的次生代谢产物，多取用______期的培养物。
8、在菌种资源开发中，筛选菌种的四个步骤为：______、______、______和______。
9、根据F质粒的不同情况可有______、______、______和______四种菌株。
10、病毒可诱导动物细胞产生干扰素，而干扰素又可刺激细胞合成______，它被入侵病毒激活后，可降解病毒的______，从而阻止了病毒______的转译和阻止有感染力病毒的合成。
二、判断题11、细菌的芽孢和孢囊都是休眠细胞，都具有相同的抗热性、抗辐射、抗干燥能力。
（）12、用涂抹法测微生物活菌数时，每个平皿中的菌液加入量是0.1ml。
λ噬菌体的基因调控
入噬菌体的基因调控入噬菌体是一种感染大肠杆菌的温和噬菌体，侵染E.coli后既能进行复制和造成细菌裂解死亡，又能整合进入E. coli 基因组并随着宿主基因组进行复制，进行溶源态生存。
溶源发育尽管十分稳定，但是仍然可以通过一些损害宿主细胞的诱导剂使之诱导进入裂解感染。
入噬菌体的裂解发育、溶源发育和溶源发育到裂解发育的诱导是研究生物分子调节优异的模型。
经过四十多年的研究，在这个模型中已经发现了众多的正调节因子和负调节因子在转录水平或转录后调节基因的表达。
I ．两种发育途径简介入噬菌体在裂解发育中的繁殖过程为吸附宿主、向宿主注射核酸物质、基因的复制和蛋白质的表达、宿主细胞的裂解和子代噬菌体的释放。
裂解发育通过使噬菌体的基因按照一定的顺序表达而完成，这样就保证了每种成分在生命周期适宜的时间表达。
裂解周期可以分为两个主要的阶段：早期感染一从噬菌体DNA 进入宿主到开始复制的这一段时期，主要合成与DNA复制有关的酶类，如参与DNA 复制、重组和修饰的酶；晚期感染—从复制开始到最后细胞裂解释放出子代噬菌体颗粒的过程，主要合成噬菌体颗粒的蛋白质外壳，由于噬菌体需要许多不同的蛋白质外科组建成衣壳和尾，因此基因组的绝大部分是用于执行晚期功能的。
噬菌体基因表达的早期阶段只有少数基因表达，并且严重依赖宿主的转录机构，例如RNA聚合酶和(T因子。
这些基因被成为早早期基因(immediate early gene)。
第二类基因称为迟早期基因(delayed early gene)。
裂解周期受到正调控作用，即每组基因只有受到恰当的信号刺激时才能启动表达。
因此，早早期基因的表达编码了迟早期基因的调控蛋白，这种调控蛋白对于迟早期基因的表达是必需的。
当噬菌体DNA开始复制时，晚期基因(late gene )开始表达。
晚期基因的表达需要早早期或迟早期基因的编码产物作为信号，在入噬菌体中，这种调控信号是一种抗终止因子。
因此，裂解性感染通常分为三个时期：第一个时期由宿主RNA聚合酶转录噬菌体早期的转录调控因子；第二个时期的基因在前一阶段表达的调控因子的作用下进行转录，此阶段表达的基因大多数为噬菌体复制所必须；第三个时期由编码噬菌体成分的基因组成，他们能够在第二个时期合成的调控因子的指导下转录。
λ噬菌体的基因调控
λ噬菌体的基因调控姓名学号：班级：目录λ噬菌体的发现λ噬菌体的结构组成1.基本结构2.λ噬菌体的核心λ噬菌体的生活周期I．两种发育途径简介II．调控发育途径的分子基础1.两种途径共同的早期基因表达途径2.溶源发育中基因的相互作用3.裂解途径的建立4.溶源和裂解的平衡5.溶源发育向裂解发育的转变λ噬菌体的侵染过程1.吸附2.穿入3.生物合成4.成熟与释放λ噬菌体的应用1.细菌的鉴定与分型2.耐药细菌感染的治疗3.分子生物学研究的重要工具4.遗传工程5.其他参考文献λ噬菌体的发现：1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg证明了J. Lederberg和Tatum用来杂交的K12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。
在E.coli K12中是有原噬菌体的存在。
Jacob和Wollman（1956年）发现了合子诱导（zygotic induction）现象，并利用合子诱导确定了几个E.coli染色体上原噬菌体的整合位点。
他们发现Hfr（λ）×F－所得到的重组子频率要比Hfr×F－（λ）或Hfr（λ）×F－（λ）要低得多。
这是由于在Hfr（λ）×F－的杂交中，原噬菌体进入无阻遏物的受体细胞质中，进行大量复制使受体细胞裂解（图8-20b），因此不易得到重组子，此现象就称为合子诱导。
现在我们再回过头来查阅一下传递等级作图，中断杂交实验以及重组作图都是采用Hfr×F－（λ）就是不致产生合子诱导的缘故。
λ噬菌体的结构组成：1.基本结构λ噬菌体是一种温和的诱导性噬菌体，其基因组除在5'端有12个可互补的碱基外均为线性双链DNA，感染时DNA形成环状。
λ噬菌体的基因组长达50 Kb，共61个基因，其中38个较为重要。
λ-DNA的基因顺序组织如图所示，按基因组功能共分六大区域:头部编码区、尾部编码区、重组区、控制区、复制区和裂解区.它们分属四个操纵子结构：阻遏蛋白操纵子、早期左向操纵子、早期右向操纵子以及晚期右向操纵子。
某理工大学《微生物学教程》考试试卷(171)
某理工大学《微生物学教程》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（230分，每题5分）1. 磺胺是细菌生长因子对氨基苯甲酸的代谢类似物，故它对各种细菌性病原体有抑制作用。
（）答案：错误解析：磺胺是PABA的结构类似物，可与它发生竞争性拮抗作用，即二氢蝶酸合成酶也可利用磺胺作底物，使某些磺胺分子与2氨4羟7,8二氢蝶啶酰焦磷酸缩合，形成一个2氨4羟7,8二氢蝶酸的类似物，即“假二氢叶酸”。
这就使得那些利用二氢蝶啶和PABA合成叶酸的细菌不能合成叶酸，生长受到抑制，而对利用其他物质的细菌无作用。
2. 1676年，荷兰的列文虎克最先用自制的复式显微镜看到了细菌等微生物。
（）答案：错误解析：荷兰的列文虎克最先用自制的单式显微镜看到了细菌等微生物。
3. 普遍转导、局限转导和溶源转变中的噬菌体均为缺陷噬菌体。
（）答案：错误解析：普遍转导的噬菌体为完全缺陷噬菌体，局限转导中的噬菌体为部分缺陷噬菌体，溶源转变中的噬菌体为正常的温和噬菌体。
4. 真菌中发现几丁质物质常存在于细胞质中。
（）[南开大学2012研]答案：错误解析：几丁质是大多数真菌细胞壁的主要成分，不可能位于细胞质中。
5. 环丝氨酸和青霉素抑制肽聚糖生物合成的机制，都属于代谢类似物对酶的活性中心发生竞争性抑制作用这一类。
（）答案：正确解析：环丝氨酸和青霉素抑制肽聚糖的生物合成是因为代谢类似物对酶的活性中心发生了竞争性抑制。
6. G＋菌的细胞壁结构只有一层，通常含有磷壁酸；G－菌细胞壁结构有两层，不含磷壁酸。
（）答案：正确解析：G＋菌的细胞壁结构简单，只有一层，由肽聚糖和磷壁酸组成；G－菌细胞壁的结构则较为复杂，分为两层，包括脂多糖、磷脂等多种组分。
7. 大肠杆菌及其他原核生物编码rRNA的基因多拷贝及结构基因的单拷贝，反映了它们基因组经济而有效的结构。
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•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上， 成为原噬菌体。 适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体， 重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体 的删除作用。 超感染免疫性 溶源性细菌，由于含有原噬菌体，故不能再 次被同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种 抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性。
第一节
克隆载体
1. 质粒载体（plasimid vectors）
2. 噬菌体载体（phage vectors）
3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors）
4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）
噬菌体简介
Bacteriophage(phage) 是比细菌还小得多的微 生物，噬菌体侵犯细菌，可 以认为它是细菌里的“寄生 虫”。 组成：蛋白质、核酸. 结构：蛋白质外壳、尾巴
基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变
体校正功能的菌株。
4、加装选择标记
野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加 装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容。
选择标记主要有两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记
(1)免疫功能失活标记 (cI筛选)
加装选择标记cI基因 cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进 入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的λ-载体进入 受体细胞后，建立溶源状态，细 菌生长缓慢，形成混浊斑；
插入可供选择的标记基因；
建立体外包装系统。
1、缩短长度 野生型:上限51kb λ-DNA：48.5kb，外源基因2.5kb λ-DNA上有40-50%的DNA是复制，裂解所不必需的， 切除便提高装载量。
根据切除的多少，将λ-DNA分为两大类载体： 插入型载体、取代型载体
插入型载体（insertion vector）
包装
E
头部包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包 装启动复合物，A蛋白切割cos位点。
4、溶源状态的建立
噬菌体感染大肠杆菌后，DNA直接整合到宿 主细胞染色体DNA上，并不裂解细胞，这种情况 称为溶源状态。
整合主要由cI和int基因的产物所激活，这两个基因的开放
与关闭取决于宿主细胞本身的性质。
插入型载体只能承受较小分子量（一般在
10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛 应用于cDNA及小片段DNA的克隆。
替换型载体可承受较大分子量的外源
DNA片段的插入，所以适用于克隆高等 真核生物的染色体DNA。
2、酶切位点的删除或增加 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有
5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重
• 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体 的75-105%，那么只能接纳48.5kb×5%=2.425kb的 DNA。 • 重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外 包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。
构建λ噬菌体克隆载体的基本策略：
切去部分非必须的区域；
抹去多余的限制性内切酶切割位点；
组操作，必须删除至1-2个.
为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还
需要增加一些单一的酶切位点.
采用定点突变技术或甲基化酶处理必 需区内的酶识别序列使其失活。
3、灭活某些与裂解周期有关的基因
将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因， 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖。 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。
•当外源DNA插入到标记基因中， 基因灭活， λ-重组分子便进入 溶菌循环，形成透明斑。
(2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选）
lacZ基因编码β-半乳
糖苷酶，能催化无色的
X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；
而空载体λ-DNA则产
噬 菌 体 的 溶 源 和 裂 解
入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。
λ-DNA载体的构建
λ噬菌体的缺陷： • 基因组太大（48.5kb）；
• 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个 BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点 （G↓AATTC）。