BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明
碱性磷酸酶显色剂使用方法
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
使用方法1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法：1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。
自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
NBT-BCIP 问题
Nitroblue tetrazolium, or NBT, is a chemical used in biochemistry and immunology in the detection of an enzyme called alkaline phosphatase. Scientists also use the compound to diagnosis conditions of the immunodefense system, such as chronic granulomatous disease. BCIP stands for 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate. This chemical compound is often used in conjunction with NBT to detect alkaline phosphatase through a series of protocols.BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate SolutionDuring this protocol, scientists prepare a solution with BCIP, NBT, levamisole and the enzyme alkaline phosphatase buffer at pH 9.5. AP buffer contains tris(hydroxymethyl)aminomethane, magnesium chloride, the polysorbate detergent Tween 20 and sodium chloride. The solution is incubated at room temperature for 24 hours and is then available to use.Detection of mRNA with Alkaline PhosphataseDetection of mRNA with alkaline phosphatase is a protocol used to study the nucleic acids mRNA and DNA in animal embryos. During this procedure, BCIP/NBT is used as a substrate for the enzyme alkaline phosphatase. BCIP/NBT is added to the embryos after they are rinsed twice in alkaline phosphatase staining buffer. Nucleic acid sites appear in purple.Electrophoresis and Western BlottingDuring this protocol, technicians separate and identify the components of proteins using electrophoresis gel apparatus and a technique called Western blotting, which requires the use of a piece of equipment containing a nitrocellulose membrane and specific antibodies. After standard electrophoresis, technicians perform the Western blotting protocol, incubating the membranes for 30 minutes in a buffer solution and at room temperature. The antibody p47-phox is added and incubated for one hour. Conjugated alkaline phosphatase antibody is added, and after one hour, also BCIP/NBT. The reaction is stopped after 15 minutes of incubation by rinsing the membrane with water.Isolation and Differentiation of Medaka CellsMedaka is a small fish that produces eggs daily and is widely used in embryonic stem cell research. According to Kursad Turksen in "Embryonic Stem Cell Protocols: Isolation and Characterization," Medaka eggs are incubated in embryo medium at 78.8 degrees Fahrenheit for seven days. Embryos are then washed in phosphate buffered saline solution, fixed in a methanol-acetone mix and stained with BCIP/NBT. Samples are then kept in the dark for 24 hours at 82.4 degrees Fahrenheit. The cells chromosomes are then observed under a microscope.References1.IHC World: BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate Solutio Protocol2.SpringerLink: Two-Color Detection of mRNA Transcript Localizations in Fish and Fly EmbryosUsing Alkaline Phosphatase and b-Galactosidase Conjugated Antibodies3."Neutrophil Methods and Protocols"; Mark T. Quinn; 20074."Embryonic Stem Cell Protocols: Isolation and Characterization"; Kursad Turksen; 2006Promega产品名称目录号数量规格浓度价格(元)BCIP/NBTColorS3771 1 1.25/2.5ml 623 DevelopmentSubstrate说明BCIP (5 - 溴- 4 - 氯- 3 - 吲哚- 磷酸) 与NBT ( 四唑硝基蓝)合用，可用于碱性磷酸酶活性的比色法检测。
预混型BCIP、NBT溶液
预混型BCIP/NBT溶液Premixed BCIP/NBT Solution华越洋----------------------------------------------介绍：华越洋预混型BCIP/NBT溶液是在BCIP/NBT底物显色试剂盒的基础改良而得的。
特点：含有BCIP和NBT两种成分的混合液，不需混合和稀释，直接使用，十分方便。
在碱性磷酸酶存在时形成暗紫色沉淀，具有和其他AP底物（包括分开提供的BCIP/NBT溶液）一样的灵敏度。
稳定，使用精心优化的溶剂，在低温条件下可以保存一年。
可用于Western Blot。
运输及保存常温运输和保存（避光），有效期一年。
自备试剂Western印迹膜洗膜液或TBST缓冲液。
使用方法按常规方法进行Western印迹膜杂交，直到跟二抗-AP复合物保温这步结束。
用Western印迹膜洗膜液洗印迹膜5次，每次至少1分钟。
注意：可以用TBST缓冲液代替Western印迹膜洗膜液。
用水迅速冲洗一次。
将印迹膜转移到本产品中（每cm2印迹膜需要0.1mL 本产品），室温平缓摇晃5-30分钟显色。
37℃可加速反应。
细心观察蛋白条带的颜色变化，显色到满意程度后（一般需要20分钟，具体跟蛋白浓度密切相关）迅速将印迹膜转移到盛有超纯水的托盘中摇晃，终止显色反应。
数分钟后需要换水，共三次。
用吸水纸吸干膜上的水分，照相或扫描处理后避光干燥保存印迹膜。
BCIP/NBT反应原理BCIPNBTBCIP被碱性磷酸酶水解后形成一个中间体。
这个中间体被异构化以后的产物与NBT 反应生成白色的中间体二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。
深圳依诺金生物地高辛杂交检测试剂盒 I 产品说明书
深圳依诺金生物科技有限公司 - 1 - 产品说明书地高辛杂交检测试剂盒 I目录号: DIGD-110装量: 10次显色检测反应保存期: 12个月.存储条件:NBT/BCIP显色底物–20℃抗DIG-AP酶结合物4℃其它组分室温试剂盒组成:阻断液母液(10x) 50 ml抗DIG-AP 酶结合物20 µl NBT/BCIP显色底物 2 ml检测缓冲液(5×) 50 ml顺丁烯二酸缓冲液母液(2x) 500 ml Tween-20 3 ml 10% SDS 20 ml 20×SSC 100 ml使用前先用DEPC/无RNase水将5×检测缓冲液及2×顺丁烯二酸缓冲液母液稀释成1×工作液.一.预杂交:1. 将膜从包装袋中取出，用干净的剪刀将膜溴酚蓝以下的部分剪去。
放入杂交袋中，在封口机上将杂交袋三面封口。
2. 加入65℃预热的Hyb高效杂交液5mL，排尽气泡，封口。
放65℃水浴振荡杂交1～2小时。
3. 如果使用杂交管杂交，则根据杂交管体积，加入适量的杂交液(5-10ml)。
如果膜的大小适中，也可以用无菌的50ml离心管(BD公司)进行，5ml杂交液已足够。
将杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟预杂交1～2小时。
二.杂交:1. 探针的处理：将标记好的探针放100℃煮10分钟，立即放冰浴冷却10分钟。
2. 将杂交袋从水浴中取出，剪去一角并尽可能的排尽袋中的预杂交液，取5mLHyb高效杂交液，加入变性的探针(1-3µl/膜，5－20ng/mL Hyb杂交液)，混匀。
加入到杂交袋中，小心排尽气泡，封口，65℃水浴振荡杂交过夜。
3. 如果使用杂交管杂交，则倒出预杂交液，另取适量的Hyb高效杂交液(5-10ml)，加入变性过的探针(1-3µl/膜，或5－20ng/ml Hyb高效杂交液)，混匀。
加入到杂交管中，杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟，杂交过夜。
BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明
BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明货号：PR1100规格：25ml/125ml保存：-20℃避光保存，复检期至少半年。
产品内容：25ml125ml25×BCIP1ml5ml25×NBT1ml5ml1×AP反应缓冲液30ml75ml×2产品简介：NBT即氯化硝基四氮唑兰(Nitroblue tetrazolium chloride)，为深蓝色无定形微溶物质。
BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate),在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）的催化作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。
使用说明：1.取40ul25×NBT加入到1ml1×AP反应缓冲液中，混匀后，再加入40ul25×BCIP混匀，即配成反应工作液，此反应液最好现配现用。
注意：根据膜的大小，1×AP反应缓冲液、25×BCIP、25×NBT的量可以等比例扩大。
2.把经洗涤的PVDF/NC膜浸入反应工作液中，于室温平缓摇动进行温育。
3.当蛋白带的颜色深度达到要求（一般约20-30分钟）时，把膜浸入去离子水中停止反应。
注意事项：BCIP、NBT为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。
操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。
相关试剂：A1800抗体稀释液（普通型）A1830AP标记抗体稀释液SA0012SABC(小鼠IgG)-AP kit。
碱性磷酸酶底物显色试剂盒
注意：根据膜的大小，AP Buffer、NBT、 BCIP 的量等比例混 合物中，于室温平缓摇动进行温育。
⒋ 细心观察反应过程，待蛋白膜上条带呈色 明显，而无明显背景时(一般约 5-15 分钟)， 把膜浸入水中漂洗停止反应。
注意：若信号太弱可 增加反应时间。
⒌ 拍摄膜照片或直接保存膜留作永久试验纪 录。
碱性磷酸酶底物显色试剂盒(BCIP/NBT)
目录号： 1925
目录编号 192501
包装单位 100ml
实验室使用，仅用于体外
产品介绍：
BCIP/NBT 是 碱 性 磷 酸 酶 （ Alkaline phosphatase ,AP）的显色底物，经免疫反应固定 的碱性磷酸酸酶可催化 BCIP/NBT 产生化学呈 色反应，在 蛋白转 印膜阳性 蛋白条 带处原 位形 成蓝紫色的化合物沉淀。
注意：若信号太弱可 增加反应时间。
⒌ 拍摄膜照片或直接保存膜留作永久试验纪 录。
产品组成、储存、稳定性：
试剂盒组成 AP reaction buffer NBT stock
BCIP stock
保存
室温或 者 4℃ －20℃ 避光 －20℃ 避光
192501 100 ml 1 ml 1 ml
常温运输，本产品收到后按照上面指示温度存放，6 个月内有效。
操作方法：
⒈ 按常规操作，将蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳，转膜（硝酸纤维素膜和 PVDF 膜均 可使用）。封闭 30~120 min，一抗孵育 1 小 时或过夜；漂洗 3~5 次，碱性磷酸酶标记 二抗孵育 30~120 min，漂洗 3~5 次。如上 述步骤采用磷酸缓冲液，需换用 Tris 缓冲 液漂洗 3~5 次以完全去除磷酸成分对于 AP 抑制作用。
“敏筛”说明书
Instruction manual (说明书)：AllergyScreen过敏原检测试剂盒1.用途AllergyScreen过敏原定量检测系统采用免疫印迹方法，定量检测人血清中过敏原特异性IgE抗体。
2.概述IgE免疫球蛋白发现始于1964年，它在I型变态反应发生机制中起重要作用。
免疫应答时B淋巴细胞分化成熟为浆细胞，并合成和分泌不同类型的抗体。
该过程由Th和Ts细胞调节，如果调节失控，通常不会造成损害的抗原也能激发免疫应答，刺激抗原特异性B细胞分化成熟为浆细胞，并产生IgE抗体, IgE抗体通过Fc段同嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面Fc受体结合。
当同一变应原再次进入机体，直接作用于IgE，并通过它的决定簇与IgE分子Fab段间的结合，形成IgE 受体聚集成片,这些变化最终导致嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒释放组胺等生物活性物质，从而产生如麻疹`荨麻疹、皮炎、关节炎，枯草热（过敏性鼻炎）`哮喘及过敏性休克等典型的I型变态反应症状。
3.检测原理特异性过敏原被吸附于硝酸纤维素膜表面，置于反应槽中。
用移液器加入病人血清，室温下孵育，标本中过敏原特异性的IgE抗体与过敏原发生反应，并连接在硝酸纤维素膜上。
将多余的抗体冲洗脱掉，再加入标记了生物素的抗人IgE 抗体，室温下孵育，冲脱未结合上的抗抗体。
然后加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温下孵育，链霉亲和素和生物素结合。
将未结合上的酶标链霉亲和素冲洗干净。
当再加入BCIP/NBT酶作用底物并孵育后，碱性磷酸酶发生特定的酶显色反应，试剂条上出现沉淀。
颜色深浅与血清中sIgE抗体含量成正比。
待试剂条干燥后，CCD相机照相，读取检测结果。
4.检测系统组成每套检测系统包括：1×12 检测条：标记有20种过敏原的硝酸纤维素膜，置于塑料反应槽中（混合过敏原组，吸入组，食物组）1×洗脱液：（TRIS/NaCl，包含0.1%NaN3）可稀释成1x500ml 的清洗液，pH=7.5 （20ml）1×标记有生物素的抗人IgE抗体（白盖，多抗），含 0.1%NaN3 1×酶标链霉亲和素（红盖），连接有碱性磷酸酶的链霉亲和素1×底物（蓝盖），BCIP/NBT12×加样吸管（300微升）1×使用说明书5.未提供的实验所需的其他工具5.1稀释液蒸馏水或去离子水5.2 其他搅拌器；量筒（500毫升），500毫升洗瓶，具10个不同板型的洗板机（也可无），避光的孵育箱（具体要求见MEDIWISS说明书）；水平混匀器；电吹风（也可无）；专用阅读仪（RAPID READER）和电脑（Windows98，Windows2000 ME或Windows2000 PROF 带USB接口）及打印机。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
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BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明
货号：PR1100
规格：25ml/125ml
保存：-20℃避光保存，复检期至少半年。
产品内容：
25ml125ml
25×BCIP1ml5ml
25×NBT1ml5ml
1×AP反应缓冲液30ml75ml×2
产品简介：
NBT即氯化硝基四氮唑兰(Nitroblue tetrazolium chloride)，为深蓝色无定形微溶物质。
BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate),在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）的催化作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。
使用说明：
1.取40ul25×NBT加入到1ml1×AP反应缓冲液中，混匀后，再加入40ul25×BCIP混匀，即配成反应工作液，此反应液最好现配现用。
注意：根据膜的大小，1×AP反应缓冲液、25×BCIP、25×NBT的量可以等比例扩大。
2.把经洗涤的PVDF/NC膜浸入反应工作液中，于室温平缓摇动进行温育。
3.当蛋白带的颜色深度达到要求（一般约20-30分钟）时，把膜浸入去离子水中停止反应。
注意事项：
BCIP、NBT为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。
操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。
相关试剂：
A1800抗体稀释液（普通型）
A1830AP标记抗体稀释液
SA0012SABC(小鼠IgG)-AP kit。