精子核蛋白染色液(苯胺蓝染色法)
精子活体染色操作卡（3种方法）
精子活体染色操作卡（3种方法）
精子活体染色操作卡
伊红染色法：
1. 滴新鲜精液 + 1滴伊红Y 溶液 30秒后高倍光学显微镜下立即观察、计数。
伊红-苯胺黑染色法：
1．10μl 新鲜精液+ 50μl 伊红-苯胺黑试剂室温放置30秒
2．取约5μl 染液-精子混合物涂片空气中干燥。
3．显微镜至少观察200个精子，计数并计算活精子百分率。
低渗膨胀法：
1．1ml 低渗膨胀液37℃预热约5min 。
2．加入0.1m1液化的精液在37℃下至少保持30min （不要超过2h ）。
3．显微镜至少观察200个精子，计数并计算活精子百分率。
注意事项
1．低渗膨胀液开瓶后，需分装放-20℃环境冷冻保存。
2．试剂盒放2－8℃环境保存，使用有效期为1年，开封后2－8℃保存可用45天
载玻片上混匀
盖上盖玻片轻轻混匀 Eppendorf 管
加盖混匀。
精子形态学染色液(巴氏法)
精子形态学染色液(巴氏法)简介：细胞学常规染色普遍使用巴氏(Papanicolaou)法，Papanicolaou Stain 最初仅用于检测阴道上皮雌激素水平以及生殖道念珠菌、滴虫等病原体。
橘黄G6与EA36或EA50联合使用，可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色和粉色。
目前大多数实验室采用成品染液，所以每种染液应注意其改良后的最佳条件。
最终胞浆染色应透明可见，核染色质应很容易辨别出来。
目前改良的巴氏染色液含有多种离子，具有多色性染色效能。
染色后胞质鲜艳、透明性好以及核膜、核仁、染色质结构清晰。
Leagene 精子形态学染色液(巴氏法) 因精子及细胞内不同等电点的蛋白质在相同的酸度下带不同的电荷，能选择性地结合相应的染料而着色。
胞核由酸性物质组成，它与碱性染料的亲和力较强；而胞浆则相反，它含有碱性物质和酸性染料的亲和力较大细胞质染色特别采用针对于精子染色的改良EA50染色液，细胞核染色采用Leagene 自主研发的无毒改良型苏木素染色液，特别适用于精子的染色，亦可用于胸水、腹水、痰液等细胞样本的染色。
组成：自备材料：1、 固定液(如95%乙醇-乙醚固定液)2、 系列乙醇3、 0.5%盐酸乙醇分化液操作步骤(仅供参考)：1、 细胞涂片用等量95%乙醇-冰乙酸固定液固。
2、 80%的乙醇浸泡1min 。
3、 70%的乙醇浸泡1min 。
4、 50%的乙醇浸泡1min 。
编号 名称DA0191 4×20ml DA0191 4×100ml Storage 试剂(A): Lea 苏木素染色液 20ml 100ml RT 避光 试剂(B): 蓝化液20ml 100ml RT 试剂(C): 橘黄G6染色液 20ml100ml RT 避光使用说明书1份5、 蒸馏水或自来水浸泡或冲洗。
6、Lea 苏木素染色液染色。
7、自来水冲洗。
8、盐酸乙醇分化液分化或盐酸水溶液分化。
9、自来水冲洗。
10、蓝化液中蓝化4min 。
精子形态与核蛋白组型转换及DNA完整性的相关性_李俊
doi：10．3969 ／ j．issn．1006-5725．2015．07．033 基金项目： 河北省人口和计划生育委员会基金项目 （编号： 2013－A08 ） 作 者 单 位 ：050031 石 家 庄 市 ，河 北 医 科 大 学 第 一 医 院 生 殖 医 学科 通 信 作 者 ：刘 芳 E-mail：liufydyy＠163．com
（收 稿 ：2014－11－30 编 辑 ：吴 淑 金 ）
精子形态与核蛋白组型转换及 DNA 完整性的相关性
李俊 杨雪梅 赵婷婷 宋亚曼 刘芳
摘 要 目 的 ：探 讨 精 子 形 态 与 精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 及 DNA 完 整 性 的 相 关 性 。 方 法 ：选 取 248 例 精 液 标 本 ，依 据 正 常 形 态 四 分 位 数 将 标 本 分 为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四 组 ，采 用 苯 胺 蓝 法 检 测 精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 比 例 ，染 色 质 扩 散 法 检 测 精 子 DNA 完 整 性 ，分 析 精 子 形 态 与 精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 及 DNA 完 整 性 的 相 关 性 。 结 果 ：检 测 标 本 中 精 子 形 态 异 常 发 生 率 为 27．82％，Ⅰ组 （正 常 形 态 ＜4％）精 子 总 数 、前 向 运 动 精 子 比 例 、核 蛋 白 组 型 转 换 比 例 均 显 著 低 于 其 他 组 （P ＜ 0．05），且 其 DNA 完 整 性 比 例 显 著 低 于Ⅲ组 （正 常 精 子 形 态 6％ ～ 8％）、Ⅳ 组 （正 常 精 子 形 态 ＞ 8％）。 正 常 精 子 形 态 与 精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 （r ＝ 0．235， P ＝ 0．000）、精 子 DNA 完 整 性 （r ＝ 0．189，P ＝ 0．003）之 间 均 存 在 显 著 正 相 关 ，精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 与 DNA 完 整 性 间 存 在 显 著 正 相 关 （r ＝ 0．219，P ＝ 0．001）。 结 论 ：精 子 形 态 异 常 可 降 低 精 子 总 数 、前 向 运 动 能 力 、精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 及 DNA 完 整 性 比 例 ， 精 子 形 态 与 精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 及 DNA 完 整 性 之 间 存 在 显 著 正 相 关 ， 且 精 子 核 蛋 白 组 型 转 换 与 DNA 完 整 性 之 间 存 在 显 著 正 相 关 。
精子DNA检测系列简介
包装规格：10人份/盒、20人份/盒 、 40人份/盒
存储条件及有效期： 试剂盒于2-8℃避光保存，有效期为12个月。
（三）
精子活体染色试剂盒 （拒染法）
检测原理：
利用荧光络黄染料（吖啶橙）具有高度的异 染性的特性，以插入的方式与双螺旋的DNA分子
结合，染色后断裂的单DNA精子呈绿色荧光。
医生可通过计算红色和黄色荧光精子即单链DNA
精子的百分率评估精子受精几率。
3、检测操作过程
检测样本：液化后的新鲜精液标本 精子洗涤 涂片 固定
三明市和众生物技术有限公司内部培训资料
生殖医学检测试剂盒系列
精子五联检
1、精子DNA检测试剂盒 2、精子DNA碎片检测试剂盒 3、精子活性检测试剂盒 4、精子形态学检测试剂盒 5、精子核蛋白检测试剂盒
影响精子受精或男性不育的因素
精子死亡率过高 精子畸形率过高 精子成熟率过低 精子染色体异常 精子数量过少 精子活动力过低 精子液化能力过低
完
正常参考值：核蛋白不成熟精子≤30%
结果： 核蛋白不成熟的精子（IM）染紫蓝色或紫色 核蛋白成熟的精子（M）染红色。
操作方法
精子液化 精子洗涤 精子洗涤
涂片
复染 洗脱 染色 固定
镜检
染色效果
不成熟精子
成熟精子
正常参考值：核蛋白不成熟精子≤30%
产品基本信息
产品注册证号：闽明食药监械（准）字2013第1400022号 执行标准号：YZB/闽明0033-2013 生产许可证号：闽食药管械生产许第20110297号
精子膜完整性检测方法的比较
精子膜完整性检测方法的比较
施文艳;薛士慧
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】1995(0)S1
【摘要】精子膜完整性检测方法的比较施文艳，薛士慧（江苏省职工医科大学，南京２１００２９）精子膜完整性与受精能力有关。
检测精子膜是否完整，已成为诊断男性不育的手段之一。
目前常用的方法是低渗肿胀试验。
但已有研究发现，渗透压相同的溶液可能对膜有不同的影响。
对此Ｌｏ...
【总页数】1页(P79-79)
【关键词】精子膜完整性;检测方法;低渗肿胀试验;试验法;实验诊断;相关性;水试验;男性病;男性不育;不育症
【作者】施文艳;薛士慧
【作者单位】江苏省职工医科大学
【正文语种】中文
【中图分类】R446
【相关文献】
1.低渗肿胀实验、苯胺蓝染色及染色质扩散实验检测精子核蛋白及膜完整性对比研究 [J], 李安娜;张美华;房振亚;邱毅
2.精子染色质扩散法检测精子DNA完整性方法探讨及临床意义 [J], 王玮玮;王厚照;张玲;刘芳
3.三种精子质膜完整性检测方法的比较 [J], 舒如明;卢文红;李鸿;周芳;许剑锋;王小强;谷翊群
4.精子膜功能完整性检测方法的改进 [J], 赵晶石;蒋瑞英;赵晶平
5.线粒体膜电势完整性和磷脂酰丝氨酸的浆膜转位作为早期凋亡标记:两种不同精子亚群的比较 [J], Barroso G.;Taylor S.;Morshedi M.;张旸
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精子核蛋白组型严重异常的临床病例治疗分析
精子核蛋白组型严重异常的临床病例治疗分析作者：董树林曲文玉王立名王蔓来源：《中国实用医药》2011年第32期【摘要】目的探讨孕早期自发流产或胚胎停育的精液实验指标。
方法 38例精子核蛋白组型严重异常的实验与治疗统计。
结果 38例精子核蛋白组型严重患有经过治疗后，连续监测病例发现核蛋白恢复正常后，其配偶自发性流产或胚胎停育发生机率明显下降，正常分娩率显著提高。
结论精子核蛋白组型异常是导致自发性流产和胚胎停止发育的非遗传危险因素，但通过药物等治疗途径可以得到改善。
【关键词】自发性流产；胚胎停育；精子核蛋白组型临床自发性流产或胚胎停止发育发病率约占妊娠率的3.6%~5.5%，因其发病机制尚未完全阐明，有学者认为可能与解剖异常、免疫失调、内分泌紊乱、感染、染色体异常及基因多态性有关，临床对此病的总体疗效不太理想。
近些年通过对自发性流产或胚胎停止发育病例分析发现男性因素逐渐增多，特别是对男性精子的研究逐渐成为热点。
本文通过精子核蛋白组型严重异常病例及治疗，总结对自发性流产及妊娠结局的研究对照仅供同行参考。
1 资料与方法1.1 一般资料统计2006~2009年我院男科门诊就诊38例精子核蛋白组型严重异常(组型转换超过50%)。
临床上其配偶有2次以上孕早期自发性流产或胚胎停止发育。
双方检查未发现其他异常阳性体征，包括双方染色体检查、免疫及感染项目检查，男女生殖内分泌检查、血糖、甲功及妇科检查。
但这38例患者精液检查发现精子核蛋白组型存在严重异常。
其中9例精子核蛋白组型超过60%，29例介于50%~60%之间。
1.2 研究指标按照WHO技术规范采集和处理检测精液标本，检测精子核蛋白成熟度。
1.3 检测方法将洗涤后精子固定于载玻片，以0.5 g/L苯胺蓝,4%醋酸溶液染色5 min后洗涤、脱色、干燥后显微镜下至少观察400个精子，计算头部染成蓝色精子数量，染成蓝色精子为不成熟精子，计算不成熟精子的百分比(%)。
1.4 检测原理精子成熟过程中，与精子核DNA结合的碱性蛋白发生组型转换，富含赖氨酸残基的组蛋白逐渐被富含赖氨酸和胱氨酸的鱼精蛋白所取代，酸性条件下苯胺蓝与赖氨酸残基结合生成蓝色化合物。
第一类医疗器械生产备案凭证
第一类医疗器械生产备案凭证备案编号：闽明食药监械生产备20140003号企业名称三明市和众生物技术有限公司住所三明市梅列区碧湖列西街道工业大楼四、五楼生产地址三明市梅列区碧湖列西街道工业大楼一、四、五楼法定代表人陈隆玉企业负责人陈隆玉生产范围一类6840体外诊断试剂、6841医用化验基础设备器具。
生产产品列表产品名称产品备案号登载日期备注缓冲液闽明械备20140013号2014-9-26样本密度分离液闽明械备20140014号2014-9-26糖原染色液(PAS) 闽明械备20140018号2014-12-16过氧化物酶（POX）染色液闽明械备20140019号2014-12-16吉姆萨染色液闽明械备20140020号2014-12-16α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）染色液闽明械备20140021号2014-12-16网织红细胞染色液闽明械备20140022号2014-12-16巴氏染色液闽明械备20150004号2015-5-7苏木素-伊红染色液（H-E）闽明械备20150005号2015-5-7液基薄层细胞制片机闽明械备20150006号2015-5-7液基细胞制片染色一体机闽明械备20150025号2015-7-28液基细胞分离制片染色一体机闽明械备20150026号2015-7-28宫颈细胞染色液闽明械备20150027号2015-8-20医用离心机闽明械备20160001号2016-6-19抗酸染色液闽明械备20160002号2016-6-19生产产品列表刘氏染色液闽明械备20160003号2016-6-19革兰染色液闽明械备20170004号2017-6-5组织固定液闽明械备20170007号2017-6-5精子染色液（改良Diff-Quik法）闽明械备20170008号2017-6-5精子染色液（shorr法）闽明械备20170009号2017-6-5精子顶体染色液闽明械备20170010号2017-6-5液基细胞处理保存试剂闽明械备20170011号2017-6-5精子染色液（活体拒染法）闽明械备20170021号2017-10-23精子染色液（巴氏染色法）闽明械备20170022号2017-10-23精子DNA染色液（荧光染色法）闽明械备20170023号2017-10-23精子DNA碎片染色液（SCD染色法）闽明械备20170024号2017-10-23精子核蛋白染色液（苯胺蓝染色法）闽明械备20170025号2017-10-23宫颈上皮组织脱落细胞染色液闽明械备20170026号2017-10-23真菌荧光染色液（一步法）闽明械备20180001号2018-2-2样本稀释液闽明械备20180002号2019-3-4阴道给药器闽明械备20180003号2019-3-4妇科白带涂片染色液（快速法）闽明食药监械(准)字2014第1400001号2015-7-28注册证有效期至2018-5-14。
精子核蛋白染色操作卡
精子核蛋白染色操作卡
标本准备：
1．0.2-0.5ml 液化新鲜精液 + 1ml 生理盐水于Eppendorf 管中 弃去上清液。
2．Eppendorf 管中加入1.5ml 生理盐水 弃去上清液。
3．重复上一步操作 离心结束后，弃去上清液。
4. 在Eppendorf 管中加入A 液约0.1-0.2ml ，混匀并计数精子密度。
5. 用洗液A 调整密度至20-40×106/ml 的精子悬液。
操作步骤：
1．精子悬液5μl 干燥。
2．滴加B 液2-3滴/涂片窗 流水冲洗。
3．滴加C 液2-4滴/涂片窗 流水冲洗。
4．载片插入D 液反应池中 流水冲洗。
5．滴加E 液2-4滴/涂片窗 流水冲洗，吹干观察。
注意事项:
1. 不同标本，成熟精子的染色本底可能会存在差异。
观察结果时，以该标本具代表性的最浅红染 的精子作为对照，较之对照更深染的紫色或紫蓝色精子便可判定为不成熟精子。
2. 试剂盒配备的组织载片高度洁净，请小心保存。
混匀
1000g 离心5min 混匀 1000g 离心5min 组织载片
涂布 室温2min
室温5min 室温5min
室温5min。
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精子核蛋白染色液(苯胺蓝法)
产品简介：
正常情况下，与精核DNA 结合的碱性蛋白（核蛋白）将经历从组蛋白到鱼精蛋白的自然成熟过程，这种成熟后的鱼精蛋白对精子基因（DNA ）具有特殊保护作用。
组蛋白被鱼精蛋白逐渐取代的过程，称之为精子核蛋白组型转换，这种组型转换具有重要的生理意义。
精子核携带着全部来自父方的遗传信息，这些基因必须在受精后才能开始表达。
受精前精子基因在鱼精蛋白的特殊保护下，紧密浓集，无任何DNA 转录作用。
但当核蛋白组型转换异常可引起男性不育或胚胎早期夭折流产，其机理为：①精子DNA 不稳定且易受损伤而难以受孕；②一旦受精，由于核蛋白组型异常，精子核不能正常解聚，从而影响了雌雄原核的融合；③胚胎不能正常发育，造成胚胎夭折而流产。
因此，组蛋白的多少是精子成熟度的一个重要指标，酸性条件下苯胺蓝能特异地与精子核组蛋白富含的赖氨酸残基结合生成紫蓝色化合物，根据着色的深浅来判断精子的成熟程度。
产品组成：
自备材料：
1、 蒸馏水
2、 新鲜精液样本
3、 恒温箱
4、 防脱载玻片
操作步骤(仅供参考)：
1、配制洗涤工作液: 取适量的10×浓缩洗涤液，以蒸馏水10稀释后即为洗涤工作液。
2、取新鲜精液标本置于恒温箱37℃或常温放置，至完全液化。
3、取上述液化精液0.2~0.5ml 置于EP 管，再加入1-1.5ml 洗涤工作液，用吸管或移液器反复吹打数次，室温2000rpm 离心5min ，弃去上清液，保留管底精子沉淀团；重复操作
编号 名称
DA1201 20T DA1201 40T Storage 试剂(A): 10×浓缩洗涤液 10ml 20ml RT 试剂(B): 固定液 10ml 20ml 4℃ 避光 试剂(C): 苯胺蓝染色液 5ml
10ml RT 避光
使用说明书
1份
3次。
4、向第3步的EP管中加入洗涤工作液约0.1-0.2ml，制成混合精子悬液。
5、取上述已制备好的精子悬液15μl，均匀涂布于防脱载玻片上，自然干燥。
6、在涂有待测精子的涂片区内滴加固定液2-3滴，室温固定5-15min，蒸馏水冲洗5-10min，并甩去多余水分。
7、在涂片区内滴加苯胺蓝染色液2-4滴，室温染色5min，蒸馏水冲洗5min，并甩去多余水份。
8、迅速吹干玻片，镜检。
如果需要长久保存样本，可将玻片依次置于70%、80%、95%
和100%乙醇中各2min，二甲苯透明，中性树胶封片。
结果：
含不成熟核蛋白的精子紫蓝色或深蓝色
含成熟核蛋白的精子浅蓝色或无色(用复染液染色后为红色)
注意事项：
1、蒸馏水冲洗载玻片时要注意控制水流速度，以免洗脱涂片区内的精子。
2、甩去多余水分应防止涂片干燥。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：6个月有效。
相关产品：
产品编号产品名称
DA0184 精子活体染色液(伊红-苯胺黑法)
DM0007 瑞氏-姬姆萨复合染色液
NR0001 DEPC处理水(0.1%)
PS0013 RIPA裂解液(强)
TC1167 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)
TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)。