多管发酵法测定水中大肠菌群
饮用水大肠杆菌测试
多管发酵法测大肠杆菌群一、实验目的1、学习测定水中大肠杆菌群数量的国标测试法（主要为多管发酵法）2、了解大肠杆菌群的数量在水中的重要性二、实验原理我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中关于生活饮用水的细菌标准具体规定如下：1、细菌总数1ml水中不超过100个。
2、大肠杆菌数1L水中不超过3个。
3、若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过10000个。
多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN 来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
三、适用范围：大肠菌群系指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
通常用此法作为粪便污染指标来评价食品以及饮用水的卫生质量。
四、检验程序：→→→→→→五、操作方法：5.1 以无菌操作，将检样10ml被测液放于含有90ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
5.2 用1ml 灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均（均液的PH值应在6.5～７.5之间，必要时分别用1mol/L 匀，做成1：100的稀释液。
氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL）调节。
多管发酵法测自来水大肠菌群
综合实验：多管发酵法测自来水大肠菌群组员：李妍、马万贵、石真真、李招柳、池小辉一、实验目的1、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系；2、测定自来水是否符合饮用水的卫生标准;3、培养学生自主设计并完成实验的能力，激发学生的科研主动性与积极性；4、通过实验了解检测水中大肠菌群的原理和方法。
二、实验原理大肠菌群——能在37 ℃24-48h内发酵乳糖产酸与产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，易于培养和观察。
粪便中存在大量的大肠菌群细菌，并且它们与水中存在的肠道病原菌成正相关性。
水中病原菌浓度很低，测定手续复杂，工作人员还有被感染传播的危险。
所以检测水的细菌学卫生标准，通常检测大肠菌群。
多管发酵法包括初发酵、平板分离和复发酵3个部分。
初发酵中发酵乳糖产酸、产气，根据培养基内指示剂颜色变化及杜氏小管内有无气体，判断是否为阳性(液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。
由于许多细菌不能发酵乳糖，不生长，而大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）乳糖起选择性碳源的作用。
溴甲酚紫是PH指示剂（碱性条件：紫蓝色；酸性条件：黄色，变色点PH=6.7），当大肠菌群的细菌利用乳糖产酸后，使原来的PH由中性下降呈酸性，培养基从紫色变为黄色。
另外，溴甲酚紫还具有抑制其他细菌（如芽孢杆菌）生长的作用)。
平板分离一般利用大肠菌群在伊红美蓝（EMB培养基）上形成紫色金属光泽菌落并结合革兰氏染色进行判断（作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核的、有金属光泽的深紫色菌落。
将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落）。
最后进行复发酵进一步证实。
三、实验材料及用具1、培养基：伊红美蓝培养基（EMB培养基）、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白培养液、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液2、溶液和试剂：革兰氏染色液、无菌水3、仪器及用具：三角瓶（2个）、发酵用试管（32个）、发酵用烧瓶（4个）、杜氏小管（36个）、培养皿（12个）、移液管、接种环、酒精灯、记号笔、油镜四、操作步骤（一）水样的采取1、自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
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接种量，ml
每100ml水样中总大肠菌群数近似数
接种量，ml
每100ml水样中总大肠菌群数近似数
3.3.3平皿培养基的配制
将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5％美蓝水溶液，加入已融化的贮备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。
多管发酵法测定水中大肠菌群实验报告
多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不的为阴性反应。
平板分离实验中把初实验产期产酸的试管的菌接到伊红美兰琼脂平板上然后培养24小时。
复发酵实验中将以上大肠杆菌阳性菌落，经涂色染色为革兰阴性无芽孢杆菌，通过次试验进一步证实原理：初发酵实验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一个杜氏小管。
乳糖能其选着作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠杆菌能发酵乳糖而产气产酸。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色。
初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不产气的为阴性结果。
平板分离：伊红美兰琼脂培养基有伊红和美兰两种染料，在此作为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料及结合，使培养基产生有金属光泽的深紫色菌落。
复发酵实验：以上大肠杆菌阴性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢的，通过此试验进一步证实。
原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠杆菌阴性结果。
材料与用具：1.培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置杜氏小管）三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有杜氏小管）伊红美兰琼脂平板2．无菌水3. 用具载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌试管灭菌吸管方法：1水样的采取从不同水体（自来水、河水）中采集样品2自来水检查（1）初发酵实验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。
在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。
多管发酵法检测水中大肠菌群数量
利用多管发酵法检测水中大肠菌群数量作者：摘要：本实验利用多管法检测水中大肠菌群数量，以反映城市供水是否符合标准。
关键词：多管发酵法大肠杆菌最大可能数(MPN) 发酵试验平板分离前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严格的常规监测。
但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培养条件苛刻，分离鉴定比较困难。
因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指标。
大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，并且检测方法简单。
因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。
1．原理：多管发酵法是根据大肠杆菌群细菌能发酵乳糖产酸产气及具备革兰氏染色阳性、无芽孢呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行实验，以求得水样中的总大肠菌群数，最大可能数（MPN）来表示实验结果。
2．实验2．1实验材料2．1．1 实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。
2．1．2 培养基：乳糖蛋白胨培养基（分装于10支试管中，内涵倒置杜氏小管）、3倍浓度乳糖蛋白胨培养基（分装于5支试管中，内涵倒置杜氏小管）、伊红—美蓝（EMB）培养基。
（培养基均为灭过菌的）2．1．3染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥碘液、番红染色液。
2．1．4水样：拧开龙头流水5分钟后取自来水。
2．1．5其他：灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。
2．2 实验步骤2．2．1初发酵试验：a 取5支装有3倍浓度乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积10ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积1ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积0.1ml。
b 用灭菌移液管分别吸取10ml水样加入到标记号的3倍浓度培养基试管中；分别吸取1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中；分别吸取0.1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中。
水中总大肠菌群测定—多管发酵法
水中总大肠菌群的测定—多管发酵法
一．原理
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法查验。
多管发酵法的原理是依照大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，和具有革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行查验求得水样中的总大肠菌群数。
实验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。
三．仪器
(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培育箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、3mm接种环。
(5)培育皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（一、五、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。
四．培育基及染色剂的制备
1．乳糖蛋白胨培育液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调剂溶液pH为～，再加入%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培育液：按上述乳糖蛋白胨培育液的制备方式配制。
除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
1适用范围本标准适用于天然水和生活水中总大肠菌群的测定。
2方法概要总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C 生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
本标准参照GB 5750-85制订。
3试剂和材料 3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。
3.1.1 组分蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g乳糖 氯化钠1.6 %溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水3.1.2 配制将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 节pH为7.2〜7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高 压蒸汽灭菌器中，以 115C 灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液: 按上述乳糖蛋白胨培养液（ 3.1 ）各组分的称量增加三倍配制。
3.3 品红亚硫酸钠培养基（供多吕发酵法用） :外购商品培养基或按卜列万法自行配制。
3.3.1组分蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾3.5g琼脂10〜30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g 左右 5.0g 5.0g 1.0ml 1000ml1000ml 蒸馏水中加热溶解，用 1mol/L 的NaOH 或HCI 调332 贮备培养基的配制先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCI调节pH为7.2〜7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.3.3平皿培养基的配制将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。
再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10分钟以灭菌。
大肠菌群数的测定方法
大肠菌群数的测定方法宝子，今天咱们来唠唠大肠菌群数咋测定的哈。
最常用的一种方法就是多管发酵法。
这就像是一场微生物的小比赛呢。
咱先得把样品采集好，比如说水啊或者食品之类的。
然后把样品放到乳糖胆盐发酵管里头。
这就像是给大肠菌群准备了一个特别的小屋子，要是有大肠菌群在，它们就会在这个小屋子里开始“搞事情”，发酵乳糖产酸产气。
你就可以看到小管子里有气泡啦，这时候就像是它们在跟你说“嗨，我们在这儿呢”。
要是在乳糖胆盐发酵管里有反应了，咱就得把这些有反应的培养液再接种到伊红美蓝琼脂平板上。
这个平板可神奇啦，大肠菌群在上面会长出有自己特色的菌落呢。
就像它们在这个新的舞台上展示自己独特的模样。
这些菌落可能是紫黑色的，还有金属光泽，就像一群穿着闪亮衣服的小演员。
通过数这些有特色的菌落，就能大概知道大肠菌群的数量啦。
还有一种方法叫滤膜法。
这个就像是用一个小筛子来筛出大肠菌群。
先把样品通过滤膜过滤，大肠菌群就被留在滤膜上啦。
然后把滤膜放到特定的培养基上培养。
那些大肠菌群就会在滤膜上慢慢长大，形成小点点一样的菌落。
咱们再数这些小点点，就能知道大肠菌群的数量咯。
不过呢，在做这些测定的时候呀，一定要注意卫生和操作规范哦。
就像咱们做饭得按照菜谱来一样，测定大肠菌群数也得按照严格的步骤。
不然的话，就可能得出错误的结果呢。
比如说，要是不小心把别的细菌也带进去了，那就像是一场混乱的聚会，根本分不清谁是谁啦。
总之呢，测定大肠菌群数虽然有点小复杂，但是只要按照方法来，就能够准确地知道样品里大肠菌群的情况啦。
这对保障咱们的健康可重要了呢，不管是喝的水还是吃的食物，知道大肠菌群的数量就能知道它们是不是安全的，就像给咱们的健康上了一道保险。
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综合实验报告书
（2014~2015 学年）
实验题目多管发酵法总测定水中大肠菌群
学院名称生物与食品工程学院
专业（班级）2012级生物工程
姓名（学号）孙大林2012215103
2015年01 月13日
多管发酵法测定水中大肠菌群
摘要：利用多管发酵法检测自来水和池塘水中大肠菌群的数量，以对不同水样的大肠菌群污染情况做出初步判断。
根据«中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验法»中有关大肠菌群的检测方法与指标对上述水样进行检测。
通过记录阳性管数并查最大可能数表（MPN）查出不同水样中大肠菌群的可能含量。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验，得出水样中总大肠菌群数，实验结果以最大可能数MPN表示。
关键词：多管发酵法、大肠菌群、最大可能数（MPN）
Abstract: the use of multiple tube fermentation test of tap water and the number of coliform group, pond water in different water samples of coliform bacteria pollution make a preliminary judgment.According to "the People's Republic of China national drinking water standard inspection » in the fecal coliform detection method and index of the water samples for
testing.Tube by a positive record number (MPN) maximum possible log tables and check of coliform bacteria may content in different water samples.Multi-tube fermentation principle is based on fecal coliform bacteria can ferment lactose produce acid gas and possess a gram negative, no spore, assumes the rods and so on characteristics, through the early (step) fermentation test, plate separation and the complex fermentation test three steps of the experiment, it is concluded that the total number of coliform bacteria in water samples, the experimental results with the greatest possible number of MPN said.
Key words: multi-tube fermentation coliform group
the greatest possible number (MPN)
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。
1 材料与方法
1.1 器材
l．培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；
2.仪器或其他用具载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。
1.2方法
1．水样的采取
(1)自来水
先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
2．自来水检查
（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。
在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图ⅩⅣ-1）。
混匀后，37℃培养24小时，24小时未产气的继续培养至48小时。
（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
（a）深紫黑色、有金属光泽。
（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。
（c）淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个，37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数。
3．湖水等的检查
（1）将水样稀释成10-1 与10-2 。
（2）分别吸取1ml10-2 、10-1 的稀释水样和1ml原水样，各入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。
另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5 ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。
（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
（4）将100、10、1、0．1（10-1 ）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-3，将10、1、0．1（10-1 ）、0．01（10-2 ）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-4，即得每升水样中的大肠菌群数。
2 结果与分析
1．结果
（1）自来水
100ml水样的阳性管数是0个；
10ml水样的阳性管数是1个。
查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是3个。
（2）湖水
阳性结果记“+ ”；阴性结果记“—”。
水样管（ml）发酵结果
100 +
10 +
1 +
0.1 +
0.01 +
查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是大于2380个；
查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是23800个。
2.分析
（1）大肠菌群的定义是什么？
答：大肠菌群：在一定条件下能够发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
（2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
答：a.来历相当：大肠杆菌与病原菌都是来自温血动物，都是可以在其粪便中检测出来的；
b.抗原性一致：大肠杆菌与病原菌对不利条件的承受力都是相同的，只要一方死亡，另一方也会死亡。
所以只要大肠杆菌不能存活的地方，病原菌一定不会存活。
c.大肠杆菌的检测较病原菌简单可靠。
D.大肠杆菌出现的频率高。
（3）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？
答：成分：蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、伊红美蓝。
作用：肠道的菌选择。
（4）经检查，水样是否合乎饮用标准？
（3）答：自来水水样合乎饮用标准；湖水水样不合乎饮用标准。
3 讨论(包括心得体会)
本实验应用多管发酵法检测自来水和池塘水中大肠菌群的数量。
以对不同水样的大肠菌群污染情况做出初步判断。
根据«中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验法»中有关大肠菌群的检测方法与指标对上述水样进行检测。
通过记录阳性管数并查最大可能数表（MPN）查出不同水样中大肠菌群的可能含量。
心得：所谓磨刀不误砍柴工，前期的搜集资料，制定方案，方法设计等相应的准备工作，可以大大降低实验过程中中的失误，避免了手忙脚乱，加快实验进程，是实验顺利开展的先决条件！在实验过程中会遇到一些挫折与失败，导致之前的努力付诸东流，但是这并不会影响我的心态以及后续的实验操作，因为我知道做实验最重要的是需要有坚韧不拔的毅力和乐观的心态。
面对失败，我要做的是细致地分析它的原因，再积极的找出解决办法，这才是做实验所应该具备的素质。
做实验遇到困难是难免的。
而解决问题的办法往往是从与同伴的交流与讨论中得出的。
与小组成员的团结协作和充分交流可以降低个人失误，从而增加实验成功的概率。