结直肠癌循环肿瘤细胞的临床研究进展

《中国癌症杂志》2009年第19卷第7期 CHINA ONCOLOGY 2009 Vol.19 No.7548结直肠癌循环肿瘤细胞的临床研究进展 ［摘要］　结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，大量患者死于术后转移和复发。

循环肿瘤细胞是存在于患者外周血循环中的肿瘤细胞，是肿瘤发生远处转移的关键，与患者预后密切相关。

本文综述近年来有关结直肠癌循环肿瘤细胞的临床研究进展。

［关键词］　循环肿瘤细胞；　结直肠癌；　肿瘤标志物；　转移 中图分类号：R730.43 文献标识码：A 文章编号：1007-3639(2009)07-0548-04Clinical progress of the research on circulating tumor cells in colorectal cancer PENG Zhi-lei,DU Xiang (Department of Pathology,Cancer Hospital,Department of Oncology,Shanghai Medical College, Fudan University,Shanghai 20032,China)Correspondence to：DU Xiang E-mail：dx2008cn@ ［Abstract ］ Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors. The majority of the patients die of metastases and recurrences after surgery. Circulating tumor cells (CTC) exist in the patients’ peripheral blood, which can be considered as the crucial step in the metastasis cascade, thus being considered as the most valuable prognostic indicator. This paper summarized the clinical research works about CTC in colorectal cancer during recent years. ［Key words ］　circulating tumor cells; colorectal cancer; tumor markers; metastases通讯作者：杜祥　E-mail:dx2008cn@ 结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有100万新发病例，大量患者死于术后转移和复发。

25%的患者在首次确诊时就已存在肝转移，另有25%的患者在随后的病程中发生肝转移。

大部分肝转移的复发患者无法进行治愈性切除。

1869年，Ashworth ［1］首次描述了在死亡癌症患者外周血中发现的类似肿瘤的细胞，并提出了循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的概念。

相似的概念包括循环癌症细胞（circulating cancer cell，CCC）、循环肿瘤微血栓（circulating tumor microemboli，CTM）和播散肿瘤细胞（disseminated tumor cell，DTC）也在近年的文献中提到。

目前的肿瘤转移理论认为，肿瘤细胞需要先从原发灶脱离并进入血液或淋巴循环，才能在远处形成转移灶［2］。

因此，在理论上CTC与肿瘤的血行转移有直接关系。

近年来检测手段的发展促进了CTC的研究。

这些研究表明CTC与肿瘤转移和预后密切相关，从而使CTC有望成为新的预测转移、预后及指导临床治疗的指标。

1　CTC研究现状　目前CTC的检测能在约10 mL 血液中寻找其中的肿瘤细胞，这意味着要在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中寻找仅有的几个肿瘤细胞［3］，因此检测方法的敏感度和特异度一直是要解决的两大问题。

以往将CTC的检测方法主要分为两类：一类是基于细胞水平的细胞分选及计数，采用免疫细胞化学法从大量的背景细胞中搜寻肿瘤细胞；另一类是基于核酸水平技术，主要采用PCR或RT-PCR的各种改进技术检测血液中的肿瘤特异性DNA或RNA序列［4］。

新近Paterlini-Brechot等［5］提出了一种新的分类方法，分为间接法和直接法。

间接法包括用免疫组织化学技术或分子技术检测组织、器官及肿瘤特异性标志物；直接法则针对肿瘤细胞的密度、大小等物理特性进行检测。

各种方法都各有其优缺点。

2　CTC特异性mRNA检测　鉴于技术的成熟性和高敏感性，基于核酸的检测方法应用最为普遍。

由于DNA在循环中较为稳定，使DNA检测得到的可能只是循环内的肿瘤负荷，而不是有活力的肿瘤细胞，近年来其应用逐渐减少。

而以肿瘤或上皮组织特异性mRNA为检测对象的《中国癌症杂志》2009年第19卷第7期549RT-PCR方法近年来应用最广。

目前最常用的指标仍是CK19、CK20、CEA和hTERT［6-10］，其他指标如生存蛋白（survivin）［6, 11］、鸟苷酸环化酶C（GCC）［10］和VEGF［12］等也得到了研究。

为了提高检测敏感度，多项指标联合检测逐渐得到应用［6-8, 10］。

在这些研究中，单项指标检测的CTC阳性率在30％～40％之间而联合检测可使阳性率上升至60％～80％。

Shen等［6］比较了恶性与良性肿瘤患者及健康对照者的CTC检出率，发现癌症组的CTC阳性率明显升高。

在Dukes A、B期，Dukes C期及Dukes D期三组之间CTC阳性率差异有显著性，且CTC阳性率高的患者肝转移发生率亦高［7］。

Uen等［8］检测根治性手术患者术前和术后1周外周血CTC，结果显示术后UICC Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者的阳性率分别为6.0%、30.3%和41.3%，而对应的术后复发率分别为2.3%、28.7%和39.7%，且CTC持续阳性提示患者术后无病生存较差。

Survivin在近年CTC检测中逐渐得到重视。

它是一种具有调节增殖和抗凋亡双重功能的蛋白，参与体内多种器官及细胞的生理过程，几乎在所有恶性肿瘤组织中均有表达，但在绝大多数正常成人组织中无表达，因而使其成为理想的肿瘤特异性标志物［13］。

Shen等［6］对不同患者及志愿者进行治疗前外周血survivin mRNA 检测，发现结直肠癌患者中的阳性率分别是57.7%，显著高于对照组，与其他实体瘤组比较差异无显著性。

另外，Survivin阳性与Dukes 分期和淋巴结转移状态明显相关。

Yie等［11］检测胃癌、结直肠癌患者及健康志愿者外周血中Survivin表达，发现在结直肠癌患者的survivin mRNA水平显著高于对照组，表达Survivin的细胞与肿瘤浸润深度、淋巴结转移状态和疾病分期相关，阳性患者转移和复发概率更高，并发现此类细胞比血浆CEA能更准确地预测复发。

3　CTC分选与计数　细胞水平的CTC检测的优点在于能保持肿瘤细胞的形态和活力，能准确计数并能对获得的肿瘤细胞进行后续研究。

此类研究的共同之处是在不同的时间节点（如治疗前、治疗后1~2周、3~5周、6~12周和13~20周）对患者血样进行CTC计数，并结合随访数据进行研究。

研究显示，如果选择的CTC 界值（cut off）恰当，就能区分预后有明显差异的两组患者。

而且CTC计数在治疗（手术或化疗）后是否比治疗前减少，在术后发生转移和无转移的两组患者中是否有明显差异均有待研究。

CTC分选和计数不仅能获知循环中肿瘤细胞的存在状态，并能将其量化，这在与临床病理指标及预后结合分析时非常有用，应用多种统计方法能挖掘更多有意义的信息。

设置合理的CTC界值，可以使这项指标成为判断预后及决策治疗的重要参数。

而在病程中的不同时间（治疗前和治疗后）对患者进行CTC计数，将能动态随访患者病情，以便及时开始新的治疗或中止无益的治疗［14-16］。

Katsuno等［17］在一项荟萃分析中指出，CTC阳性与淋巴结阳性及肝转移明显相关，CTC阴性组的无病生存期明显长于CTC阳性组。

该研究还指出，由于门静脉系统的过滤作用，外周血中的CTC会少于门静脉血中的CTC，提出在手术时应该在门静脉采血，以提高CTC检测的敏感性。

总之，CTC的检测因检测方法、检测指标、患者病期以及是否接受干预治疗等情况不同而出现不同结果［6-12, 14-16, 18］。

在一般情况下，早期（Ⅰ、Ⅱ期）患者CTC阳性率较低，中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者阳性率较高。

就检测方法而言，RT-PCR法比免疫组织化学法敏感度更高［19］，而且多项指标联合检测的阳性率高于单项指标。

治疗的干预（包括手术和化疗）会使CTC计数减少，甚至转阴。

4　CTC基因表达谱检测　应用基因芯片能在同一时间研究大批CTC基因的表达情况，近年来该技术已用于寻找特异性CTC基因及其与预后的关系。

Smirnov等［20］将3例转移性肿瘤（其中1例为转移性结直肠癌）患者外周血中的CTC富集，比较CTC去除前、后血样本中的基因表达谱，发现EpCAM家族的TACSTD1和TACSTD2基因及KRT19基因在CTC中呈高表达，CEA/CEACAM5基因在结直肠癌患者的CTC中呈高表达，表明该方法能有效获得CTC 的特异基因表达谱。

随后将筛选出的35个差异表达基因在30例转移性结直肠癌患者的富集CTC样本中验证，发现KRT19、AGR2（hAG-2）、S100A14、S100A16、CEACAM5、FABP1和KRT20仍然高表达。

以KRT19、AGR2、S100A13、ASGR2和TST的联合表达来区分转移性肿瘤组和对照组，准确率达81.9%。

Solmi 等［21］通过比较结肠黏膜和血细胞的基因表达550差异，得到10个上皮组织特异性基因，然后在结肠癌患者和对照组外周血中验证，但前后结果未能吻合，提示组织及细胞分化差别可能只是由少量基因决定。

Valladares-Ayerbes等［22］通过数字差异显示（digital differential display，DDD）寻找在胃肠道肿瘤中高表达但在血及骨髓中缺失的基因，筛选出10个基因作进一步研究，其中PKP3、LGALS4、CLDN3和EFNB1基因的蛋白表达产物参与细胞黏附，S100A6和S100A16与钙依赖蛋白结合有关，ASS1参与精氨酸琥珀酸合成，并发现PKP3和AGR2在肿瘤患者和对照组外周血中表达差异有显著性，提示这2个基因有可能用于检测CTC。

5　问题与展望　现有的TNM分期系统在预测肿瘤复发和转移方面准确率不够，淋巴结转移阴性患者在接受根治术后仍有25%发生远处转移，提示肿瘤转移过程有两种可能。