植物生理学实验报告植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定
植物生理学实验课件9植物组织中可溶性蛋白的测定
可溶性蛋白质含量的计算
可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的 蛋白质量（ μg ） × 提取液体积5/0.1
示意如下：
0.35
Y=-0.00381+0.032029*X 0.30 r=0.9992
0.25
Absorbance
0.20
植物组织中可溶性蛋白的测定
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶 色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）
课上笔记
三个指标
– 蛋白质含量
考马斯亮蓝
– 新叶2份 – 老叶2份，一次次加 – 转移到1.5毫升 – 显色反应做2次，合计4次（调零磷酸+考马斯亮蓝
– MDA含量
沉重，磨好， 反求诸己
实验原理
in darkness at 30
No 3: 10ppm ABA 20 ml 提取
称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol， pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
显色反应
可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于 上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反 应呈蓝色。在595nm处有最大吸收峰。
实验步骤
制备匀浆
48小时前预处理:称取叶片三份,每份1g（最好打圆孔），30度恒 温箱放置。
No 1: water 20ml (control);
No 2: 10ppm BA 20 ml; ℃ 2d.
0.15
0.10
0.05
0.00 0
2 4 6 8 10
实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定(精)
实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ 考马斯亮蓝 G – 250 染色法一、原理考马斯亮蓝 G – 250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高（比 Lowry 法灵敏 4 倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物材料。
（二）试剂1. 标准蛋白质溶液（ 100 μg ／ mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。
2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％（ W ／ V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
三、实验步骤1. 标准曲线的绘制取 6 支试管，按表 26–1 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。
植物衰老生理实验
一、实验目的和要求：（1）了解掌握可MDA测定的原理和方法。
（2）掌握用离心机、分光光度计、恒温水浴箱的基本方法和步骤。
二、实验内容和原理：内容：植物组织MDA的测定原理：植物叶片衰老过程中，自由基代谢失调并在体内积累（MDA:膜脂过氧化的产物之一）。
MDA测定：MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处，消光系数为155 (mM)-1 cm-1MDA含量计算公式MDA（mM）=(A532-A600)/(155*L) L为比色杯厚度（cm）蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450三、主要仪器设备和材料试剂：材料：可溶性蛋白测定时的上清液（新叶、老叶）各1mL仪器：离心机、分光光度计、恒温水浴箱器材：试管架、离心管、移液管、洗耳球、托盘天平试剂：磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）、TBA与TCA混合液四、操作方法与实验步骤：取出上清液，各加入TBA与TCA混合液4.0mL，92ºC水浴保温30min，空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml （ 92ºC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min;10000rpm，测定A532, A450和A600五、实验数据记录和处理：新叶A532：0.201、A450：0.714、A600：0.033，老叶A532：0.309、A450：1.523、A600：0.060，六、实验结果与分析：实验结果：新叶：MDA（mM）=(A532-A600)/(155*L)=（0.1843-0.0227）/（155*1）=0.00108 mMMDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450=6.45（0.1843-0.0227）-0.56*0.699=0.684µM老叶：MDA（mM）=(A532-A600)/(155*L)=（0.4403-0.0967）/（155*1）=0.00161mMMDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450=6.45（0.4403-0.0967）-0.56*1.187=0.753µM实验分析：1、从实验结果上来看，新叶的MDA含量明显低于老叶MDA含量，这是自由基代谢失调并在体内积累造成的。
植物生理学实验：实验五 丙二醛含量测定
实验原理
丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（ TBA）反应产生红棕色的三甲基复合物（3,5,5´-三 甲基恶唑2,4-二酮），该物质的吸光系数为 155mmol/(L·cm)，在532 nm处有最大吸收峰， 并且在600nm处有最小光吸收。
O
O
OH
HN 2
+
S NO H
硫代巴比妥酸
OO
100 OC
HN
N
H
H
丙二醛
HS
N H
O HO
N H
S
3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮
（三甲川）
实验原理
可溶性糖对此反应有干扰，为消除这种干扰可使用以 下公式算出MDA浓度（μmol/L），并进一步算出单 位质量组织中MDA含量（μmol/g）。
C（μmol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450 A450、A532和A600分别表示在三种波长处的吸光度值
1. 取0.5g叶片材料，加2mL5%TCA研磨后将匀浆转入离 心管，再用3mL5%TCA洗涤研钵后转入离心管。将匀 浆在3000r/min下离心10min。
2. 取上清液2mL，加0.67%TBA2mL，混合后在100℃水 浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。
3. 分别测定上清液在450nm，532nm和600nm处的吸光 度值（以0.67 %硫代巴比妥酸溶液为空白），按公式 计算MDA浓度
实验目的；实验材料、仪器设备与试剂
目的：学习和掌握丙二醛法测定植物叶片中过氧化脂质 含量的原理和方法。
仪器 分光光度计、离心机、电炉； 研钵、天平、试管架、离管、移液管、滤纸等。
试剂 5%三氯乙酸（TCA）；0.67%硫代巴比妥酸（用 10%TCA配制）；石英砂。
植物衰老生理实验（可溶性蛋白含量）
一、实验目的和要求：（1）了解掌握可溶性蛋白测定的方法。
（2）掌握用离心机、分光光度计的基本方法和步骤。
二、实验内容和原理：内容：植物组织中可溶性蛋白的测定原理：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。
可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。
在595nm 处有最大吸收峰。
02468100.000.050.100.150.200.250.300.35Protein content ( g)A b s o r b a n c e 三、主要仪器设备和材料试剂：材料：叶龄差异明显的叶片（新叶、老叶）仪器：离心机、分光光度计器材：试管架、离心管、移液管、洗耳球、研钵、电子天平、托盘天平试剂：磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8）、考马斯亮蓝四、操作方法与实验步骤：称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心15min ，取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，冰箱保存。
剩余上清液取20-50ul 加入5ml 考马斯亮蓝，595nm 比色。
五、实验数据记录和处理：取595nm的OD值平均后可得，新叶1.125，老叶0.423上清液总体积：新叶5.0ml，老叶5.0ml将595nmOD值带入标准曲线Y=-0.00381+0.032029*X得到新叶蛋白质质量=(1.125+0.00381)/0.032029=35.24μg老叶蛋白质质量=(0.423+0.00381)/0.032029=13.32μg可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=(m*v/v’)/W新叶可溶性蛋白含量=(35.24*5/0.05)/1.00=3524.00μg/g.FW老叶可溶性蛋白含量=(13.32*5/0.05)/1.00=1332.00μg/g.FW六、实验结果与分析：实验分析：新老叶可溶性蛋白含量有明显的差异，新叶的可溶性蛋白含量明显高于老叶可溶性蛋白含量，由此可知：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。
植物衰老生理 植物组织中可溶性蛋白的测定 浙江大学植物生理学实验课件
实验步骤 l 制备蛋白提取液
称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5.00ml 磷 酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中 研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下 （4C）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。 注意：
植物衰老生理1
植物组织中可溶性蛋白的测 定
实验原理
衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最 终自然死亡的过程。
Developmental signals
Environmental signals
Decrease in photosynthesis,
activation of senescence program
可溶性蛋白质含量的计算
可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的 蛋白质量（ μg ） × 提取液体积/（测定加样 量*鲜重）
植物衰老生理2
Hale Waihona Puke 植物组织中 丙二醛的测定MDA测定
MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA) 反应，形成三甲基复合物，该复合物 – 最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰 600nm处 – 消光系数为155 (mM)-1 cm-1
l （但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬 液,做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检 测的极端条件,使得该法实验数据重现性差;同时,在 560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的 SOD,也无法获得100%的对O2.-抑制率.为此,人们在增加 甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA 助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。）
植物生理学中各项生理指标的测定方法
一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。
三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
植物生理学中各项生理指标的测定方法
一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。
三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
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实验报告
课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证
实验项目名称：植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定
一、实验目的和要求
1.掌握植物组织中蛋白和丙二醛（MDA，malonyldialdehyde）
提取。
2.掌握用比色法测定组织粗提液蛋白质和MDA.
3.掌握植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定方法；
4.了解植物衰老的原理。
二、实验内容和原理
衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能自然衰退，最终导致死亡的过程。
衰老时生理生化变化主要有：蛋白质含量下降，生物膜降解，核酸含量的变化，光合速率下降，呼吸速率下降，植物内源激素的变化等。
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。
自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA。
（1）可溶性蛋白测定的原理
（2）考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸
收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从
0~1000g/ml。
据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白
为常用的标准蛋白。
（3）待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。
测定595nm
吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋
白的含量。
（4）MDA测定原理
（5）MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成粉红色复合物（3，5，5－三甲基噁唑2，4-二酮），该复合
物在532nm处有最大吸收峰；600nm处是最小吸收峰，两
峰差值的消光系数为155 (mM)-1 cm-1
（6）超氧物岐化酶（SOD)活性测定原理：
→ H2O2+ O2
2O2·−+2H2O SOD
四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法:核黄素受光照产生
的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最
大吸收,而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。
通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含
量。
三、主要仪器设备
准备材料：叶龄差异明显的叶片若干
仪器：离心机、天平、制冰机、分光光度计，研钵、移液枪、移液管、离心管等。
四、操作方法与实验步骤
(一)可溶性蛋白测定
（1）制备蛋白提取液
称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
（2）0–100μg/ml蛋白标准曲线的制作
（3）显色反应（样品的测定）：
取40μl蛋白提取液+160μl磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。
对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。
(二)MDA测定
取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液 4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92ºC水浴保温30min
空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml （92ºC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min; 10000rpm
测定A532, A450和A600。
(三)超氧物岐化酶（SOD)活性测定
称叶龄差异明显的叶片各0.5g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为酶提取液。
在暗光条件下加入3mL NBT反应液和100μL酶提取液于试管中，25℃照光（4000-10000lux)并计时,6-25min后出现颜色变化， 9min 后测560nmOD值。
同时作空白实验。
根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/gFW)。
一个酶活单位相当于引起3mL NBT反应液达到50%抑制所需要的酶量。
测定时用未照光NBT反应液调零。
五、实验数据记录和处理
(一)可溶性蛋白测定
标准曲线：
显色反应：
叶片种类OD值
新叶0.823
老叶0.152
新叶蛋白质量：y = 164.08 * 0.823 - 3.6176 =131.420μg
老叶蛋白质量：y = 164.08 * 0.152 - 3.6176 =21.322μg
在标准曲线上查得新叶蛋白质量为131.420μg，老叶为21.322μg
可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg ）×提取液体积/（测定加样量*鲜重）
新叶可溶性蛋白含量=131.420μg *5ml/（40*10-3ml*0.50g ）=32855μg/g.FW 老叶可溶性蛋白含量=21.322μg *5ml/（40*10-3 ml*0.50g ）=5330.6μg/g.FW
MDA (mM )=532600 ，L 为比色杯厚度cm 求得新叶MDA （mM ）=（0.083-0.020）/155/1=4.065*10-4（mM ）
老叶MDA （mM ）=（0.212-0.053）/155/1=1.026*10-3（mM ）
蔗糖对MBA-TBA 反应有干扰，可用下式消除：
MDA(µM)=6.45(A 532-A 600)-0.56A 450
求得新叶MDA (µM)=6.45（0.083-0.020）-0.56*0.169=0.3117 (µM)
老叶MDA (µM)=6.45（0.212-0.053）-0.56*1.365=0.2612(µM)
(三)
SOD 活力(单位gFW )=（对照管OD 值−测定管OD 值）
对照管OD 值∗0.5
新叶：(1.288-0.514) /（1.288*0.5）=1.2019（unit/gFW)
老叶：(1.223-0.893) /（1.288*0.5）=0.5124（unit/gFW)
六、实验结果与分析
(一) 可溶性蛋白测定
新叶=32855μg/g.FW >老叶=5330.6μg/g.FW
说明在叶片衰老的过程中，可溶性蛋白的含量减少。
(二)
MDA 测定 排除蔗糖干扰，叶片衰老过程中MDA 的含量在增加。
(三) 超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定
高等植物叶片中SOD 活性随衰老而下降
七、讨论、心得
1.比较新老叶片可溶性蛋白和MDA的差异。
新叶可溶性蛋白较老叶多，而老叶中MDA的含量在增加。
叶片在衰老过程中，可溶性蛋白减少，丙二醛含量增加。
2.植物组织中哪些物质对可溶性蛋白和丙二醛测定（TBA法）干扰较大？
丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用TBA在酸性条件下加热与MDA反应，生成红棕色的三甲川，三甲川的最大吸收波长在532nm。
由于植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，而且糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收，因此测定植物组织中MDA与TBA反应产物含量时一定要排除可溶性糖以及催化产生可溶性糖的酶的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
3.丙二醛测要第二次离心？可溶性蛋白可以在比色前第二次离心吗？
3.1
测定丙二醛时，加入TBA溶液摇匀，又经过沸水浴加热，所以上清液中已混有不少杂质，需再次离心去除TBA与丙二醛显色反应过程中产生的不溶性物质。
3.2
离心的原理是：由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同。
离心的目的是相互间的分离。
可溶性蛋白在加入考马斯亮蓝之后，需“混匀后放置2min”，其原因是：蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间达到平衡。
而考马斯亮蓝G-250和蛋白质是通过范德华力结合的，我猜测，若再二次离心，范德华力有可能不足以抵抗离心过程中的离心力，从而失去实验效果。
4.可溶性蛋白和MDA两个指标也常作为植物逆境受害的指标？
可溶性蛋白和MDA常作为植物逆境受害的指标。
一般植物在逆境条件下，如高温，盐碱，以及强光等逆境条件下会产生膜质过氧化。
而丙二醛含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现，丙二醛含量高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。
可溶性蛋白指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白，它是重要的渗透调节物质和营养物质。
而植物在水分胁迫下, 可溶性蛋白会部分转化为氨基酸, 从而增加渗透性物质。
比如随着干旱胁迫的加重, 可溶性蛋白随着水分胁迫的加强会呈现出降低的趋势1。
在低温下，可溶性蛋白也会逐渐降低。
1祁伟亮,冯鸿,刘松青,陈洁,龚壁燃,夏杰,张莉,任迎虹.不同桑品种在干旱胁迫下脯氨酸及可溶性蛋白质含量
的变化规律研究[J].中国野生植物资源,2017,36(05):34-36+39.
（不考虑长时间后植物不断失水组织内蛋白质含量突然增高的情况[2]）
2刘明池.黄瓜幼苗在低温下相对电导率、SOD及可溶蛋白含量的变化[J].华北农学报,1992(02):118-119.。