云南农业大学动物生物化学实验期末复习参考资料

动物生物化学实验实验室基本知识一、实验室规则1.失火：及时断电2.触电：当50Hz的电流通过人体，电流达到25mA时，会使人发生呼吸困难，电流强度达到1000mA以上时会使人致死3.化学灼伤：立即用大量水冲洗15min4.生物化学基本实验技术：离心技术、光谱技术、层析技术、电泳技术5.离心技术：根据物质的质量、沉降系数及浮力因素等不同，应用高速旋转产生强大的离心力，使物质分离、浓缩、提纯的方法。

6.离心机的使用方法：1. 使用前先检查变速旋钮是否在“0”位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。

2. 离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多,占管的2/3体积为宜,以免溢出。

将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。

3. 将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。

如不平衡可调整缓冲用水或离心物质的量。

4. 将平衡好的套管，按对称方位放到离心机插孔中。

把不用的离心套管取出，盖严离心机盖。

5. 接通电源，开启开关，平稳、缓慢移动调速手柄，至所需转速。

计时。

6. 当达到离心所需时间后，将调速柄慢慢调回零位，关闭开关。

待离心机自动停止转动后，再打开离心机盖取出样品。

7. 用完后，取出套管中橡皮垫洗净，冲洗外套管，倒置干燥。

离心技术注意事项：1.离心机要置水平位置，以保证旋转轴与地面水平面垂直。

保持良好的通风环境，避免阳光和热源直接照射。

2.使用前应检查离心机转头转速，不得过速使用。

禁止离心机不加转子空转且确认转子已放稳，一定要选择适宜的转子。

3.样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡(台称)，平衡后把它们放置于转子的对称位置，严禁装载奇数的离心管。

严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

4.离心机工作前一定要检查离心机盖是否盖严，之后打开电源开关，调整离心时间。

5.启动离心时转速应由小至大，缓慢升速，达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。

6.在使用过程中，若发现声音不正常，应立即停机。

7.离心结束，要等到转速为零时才能打开离心机盖，取出样品。

调整调速旋钮至零位，同时关闭电源。

8.每次使用后，要仔细检查转头，及时清洗、擦干。

长期不使用，应将转子取下擦拭涂油并妥善保管。

7.离心的基本术语：（1）离心力（F）：在一定角速度下做圆周运动的任何物体都收到一个向外离心力（2）相对离心力（RCF）:离心力转化为重力加速度的倍数（3）沉降系数（S）：颗粒在单位离心力作用下粒子移动的速度。

S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间，单位为秒。

8.分光光度法或分光光度技术：利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法。

使用的仪器称为分光光度计。

9.比色皿：可见光用玻璃材质；紫外光用石英材质10.吸光度（A）：又称光密度（OD）或消光度（E），表示光被吸收的量度。

11.朗伯-比尔定律：光密度（OD）或吸光度（A）与被测溶液的浓度（C），液层的厚度（L）成正比；而透光度（T）的对数则与溶液的浓度（C），液层的厚度（L）成反比，表示为OD=KCL,此关系为朗伯-比尔定律12.标准管法根据OD1=K*C1*LOD2=K*C2*L则OD1/OD2=C1/C2待测定液浓度（C1）=（待测液光密度OD1/标准液光密度OD2）*标准液浓度（C2）要求两者浓度必须在光度计有效读数范围内（一般在0.1～1.0之间），同时要求配制的标准溶液的浓度应尽量接近被测定溶液13.标准曲线法：各个未知溶液只要按相同条件（与标准溶液相同）处理，在同一光度计上测得光密度值，即可迅速从标准曲线上查出相应的浓度值14.原子吸收分光光度计：其中紫外光区，波长范围为200~400nm；可见光区，波长范围为400~760nm。

15:分光光度计可见的使用方法：1. 开机前的检查：开机前打开样品室盖，检查样品室内是否有物品挡在光路上。

光路上有阻挡物将影响仪器的自检，甚至造成仪器故障。

2. 接通仪器电源，预热20～30分钟后，用波长选择旋钮设置测试所需波长。

3. 将校正黑体置于光路，用〈MODE〉键选择“T”测试方式，调节T 为“000.0”。

4. 将空白溶液与待测溶液分别倒入比色皿中，把盛有溶液的比色皿放入比色架中（注意比色皿的光面和毛面不要放反），盖上样品室盖，使空白溶液对准光路，用〈MODE〉键选择“T”测试方式，按“100%”键调节光度计读数为“100.0”。

用〈MODE〉键选择“A”测试方式，看光度计读数是否为“0.000”。

如是，则可以开始测定待测溶液的吸光度值。

5. 轻轻拉或推动比色架固定拉杆，使第二个比色皿溶液处在光路中，此时读数即为该溶液的吸光度。

6. 依次拉或推出第三，第四个比色皿，分别读取溶液的吸光度值。

7. 测定完毕，先打开样品室盖，再关闭电源。

将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。

16:层析技术：又称色谱技术。

利用被分离混合物中各组分的物理、化学及生物学特性（主要指吸附能力、溶解度、分子大小、分子带电性质及带电量的多少、分子亲和力等）的差异，当它们通过一个由互不相溶的两相——固定相和流动相组成的体系时，由于混合物各组分在两相之间的分配比例、移动速度不同而将混合成分分开的技术17:按固定相分类：纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相分类：气相层析和液相层析18:凝胶层析：又称凝胶过滤、分子筛过滤、凝胶渗透层析等。

原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开从而达到分离的方法分子筛效应：分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量由大到小的顺序流出层析柱，凝胶表现分子筛效应，凝胶层析又称分子筛层析根据层析原理分类：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析19.电泳技术：带电粒子在电场中向其与自身电荷相反的电极移动的现象。

蛋白质的等电点（PI）：当蛋白质溶液处于某一PH时,蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的PH。

20.DNA和RNA的区别组成单位不同：DNA的组成单位是脱氧核苷酸，RNA的组成单位是核糖核苷酸，组成碱基不同：DNA的组成碱基是ATGC，RNA的组成碱基是AUGC组成五碳糖不同：DNA的组成五碳糖是脱氧核糖，RNA的组成五碳糖是核糖，空间结构不同：DNA是双螺旋结构，RNA一般是单链。

功能不同：DNA是遗传物质，RNA一般在细胞中不作为遗传物质。

21.微量移液器的使用：调节体积选取钮至所需值，套上吸头，旋紧。

垂直持握移液器，用大拇指按下液体吸放钮至第1档，将吸头插入待吸溶液，松开大拇指使吸放钮回复原位。

将移液器移入准备接受液体的仪器，用大拇指再次按下液体吸放钮，至第1档后继续至第2档以排空液体。

移液枪以右手旋方式调，顺时针方向调量程变小，逆时针方向调量程变大。

22.吸量管的使用：（1）正确拿法:中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。

（2）取液:用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。

23.溶液的配制方法：百分浓度：如2%的醋酸：每100g溶液中有2g醋酸（w/w）（1）百分浓度的配法：a.重量与体积百分浓度（W/V）：即每100ml溶液中含有溶质的克数。

如欲配制5%（W/V）NaCl溶液，则称取5g NaCl用少量蒸馏水溶解后，再加水到100ml即可。

b. 体积与体积百分浓度（V/V）：即每100ml 溶液中含有溶质的毫升数。

如欲配制 30%（V/V）的醋酸溶液，即用量简量取30ml冰醋酸（含醋酸近100%），加入蒸馏水至100ml。

（2）摩尔浓度溶液配法：在每升溶液中所含溶质的摩尔数。

如配制1 mol/L NaCl溶液的方法为：已知NaCl的分子量为 58.5，即精确称取NaCl 158.5g，用少许蒸馏水溶解后转入1000 ml容量瓶中，最后加蒸馏水至容量瓶刻度，混匀即可。

摩尔浓度要求的精确度为1/100。

配制时溶质称量应需用1/1000的天平，溶剂体积要用容量瓶定量。

组织匀浆：指将动物组织细胞在适当的缓冲溶液中研磨，使细胞膜破坏，细胞内容物溶解或悬浮于缓冲液中形成的混悬液。

实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验原理：考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595 nm波长处比色测定。

2~5min即呈最大光吸收，至少稳定1h。

10~100g/ml蛋白质范围内均可。

思考题：在对某一样品测定其含量时，为什么有时需对样品做稀释？采用分光光度法测定样品含量时，有时需稀释样品，为什么？1) 光度计上的读数标尺，并不是所有读数都符合比尔定律。

2) 标尺上最准确的区域是在光密度值0.1-1.0之间，读数如超出此范围外，表明溶液的浓度不是太稀就是太浓。

3) 溶液浓度太稀读数在光密度0.1以下，读数与浓度不成正比；浓度太大读数则在标尺的另一端，其光密度每单位的改变即表示着浓度的巨大变化，微小的读数误差将引起浓度的巨大错误。

4) 用光度计测定时要调整溶液的浓度，使读数值落在标尺的准确区域内，这样才能减少误差，得到比较准确的结果。

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验原理：丙二酸的结构与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞相结合琥珀酸脱氢酶的活性中心，从而抑制该酶的活性，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

这种抑制作用即属酶的竞争性抑制作用。

液体石蜡作用或琼脂：封闭反应液，可以制造无氧环境，从而不用抽真空设备即可观察实验结果实验步骤：将各管置37℃恒温水浴中保温，30 min内观察各管颜色的变化。

实验四血液葡萄糖的定量测定实验原理：葡萄糖（C6H12O6）是一种多羟基的醛类化合物。

其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基（-CHO )被氧化成羧基( -COOH ),而铜试剂中的二价铜（Cu2+），被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu2O）而沉淀。

氧化亚铜可使磷钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色。

其生成蓝色的深浅与血滤液中葡萄糖浓度成正比。

福林—吴宪血糖管的中间部分变细有何作用？福林—吴宪二氏法测定血糖是在特制福林—吴宪血糖管中进行。

该血糖管于4ml容量处，管颈缩小成一细管状，这样可以减少在煮沸时管内液体与空气的接触，以避免还原生成的亚铜被空气中的氧再氧化，降低实际结果。

实验步骤：1:4磷钼酸溶液加至25刻度处后，用橡皮塞塞紧管口颠倒混匀，用空白管调“0”点，在420nm波长处进行比色，读取并记录各管光密度值。

思考题：1.简述福林-吴宪氏法测定血糖的原理2.血糖管的结构有何特点？使用时应注意什么？血糖管在4ml容量处，管颈缩小成一细管状，底部为球状。

注意事项：1）等水沸腾后，才能放入血糖管。