吲哚乙酸氧化酶活性的测定
植物生理学实验
植物根系活力的测定
也可以测定溶液中被氧化的α-萘胺量， 来表示根系活力的大小。α-萘胺在酸性 环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用 生成红色的偶氮染料，通过比色测定α萘胺含量。
α-萘胺氧化反应如下： NH2
[O]
NH2
OH
α-萘胺
α-羟基 -1- 萘胺(红色)
12
植物根系活力的测定
SO3H + 2H+ + NO-2 NH2 对氨基苯磺酸 SO3H + 2H2O N+≡N 重氮化合物
7
蔗糖浓度(1mol/L)
渗透势(MPa)
质壁分离的相对浓度 （作图表示）
0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 三. 结果计算 测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分 离的最高浓度平均值（C）后，按实验1中的公式φS =iRCT计算溶 液的渗透势或植物组织的渗透势(或水势)。 四.实验作业 1. 试述细胞渗透作用的原理。
磷含量(%)= C×比色溶液体积×分取倍数 ×100 6 样品重×10 式中： C---从标准曲线上查得的P2O5的浓度（单位ug/ml） 106---将微克换算成克 100---换算成百分数 分取倍数：消化液定容体积 / 吸取消化液体积(ml)
16
实验六 硝态氮含量的测定
氮是植物的三大要素之一，大多数植物，尤其是陆生 植物最主要的氮源是硝态氮。植物从土壤中吸收硝酸 盐，一部分在根内被还原为氨，再转变为有机含氮化 合物(氨基酸或酰氨)向植物地上部分运输，其余部分 则运到叶片中再还原。植物体内硝酸盐的含量能反映 出土壤中硝态氮的供应情况，因此可作为对土壤施肥 的指标。 一、原理 植物中的硝酸盐可以用1%醋酸溶液提取，在 PH5.6的条件下，用锌粉将硝酸根还原为亚硝酸根。 亚硝酸根在酸性条件下与磺胺和-萘胺反应，生成玫 瑰红色的偶氮化合物，其颜色的深浅与硝态氮的含量 在一定范围内呈线性关系。主要化学反应如下：
吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书 微量法
吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4105规格：100T/48S产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入5mL蒸馏水备用。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入3mL蒸馏水备用。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。
临用前加入5.71mL50%乙醇（乙醇（V）：HO（V）=1：1）溶解备用。
2可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入15mL试剂四溶解。
O（V）标准品：粉剂×1支，-20℃保存，10mg吲哚乙酸。
临用前加入1.14mL50%乙醇（乙醇（V）：H2=1：1）溶解制成50μmol/mL的标准溶液。
可分装后-20℃保存。
产品说明：吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。
IAA氧化酶能调节植物体内吲哚乙酸的的水平，从而影响植物的生长。
作用生成红色产物，在530nm下有最大吸收峰。
酶活力的大小可用破坏IAA IAA在无机酸条件下与FeCl3的速率表示。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
测定操作：1、样本处理：第1页，共3页（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
12000g4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或微生物样品的制备：先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。
12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2、操作步骤：（1）可见分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至530nm。
吲哚乙酸氧化酶活性的测定
简述IAA 氧化酶活力测定的原理。
制备酶液时，为何加入pH 6.1 的磷酸缓冲液。
酶促反应时，为何要加入MnCl2和2，4-二氯酚。
比色时，为何要选在530nm波长处？ 现有黄豆芽、绿豆芽两种材料，测定黄豆芽的吸 光度值为 A1，绿豆芽的吸光度值为 A2，且 A1>A2， 试比较这两种材料下胚轴中哪个 IAA 氧化酶活力 大，为什么？
实
验
（设计性实验）
结果总结
不同培养基对怀地黄愈伤组织生长情况的影响
培养基 接种数 (瓶*片）
13*3
最早出愈 时间 （d）
18
出愈率 （%）
97.43
污染率 （%）
7.69
愈伤生长 情况
切口处较多出 愈，黄色颗粒 状，偶见灰白 色愈伤 切口及与培养 基接触处生长 愈伤，黄色透 明，较湿润 切口及与培养 基接触处生长 愈伤，黄白色， 湿润
20
平均叶 片数 （个/株）
0.02 +6-BA0.2 MS+NAA0.02 +6-BA0.5
12*3
15
4
4
14*3
10
5
5
MS+2,4-D1.0
MS+2,4-D1.0 +6-BA0.4 MS+2,4-D1.0 +6-BA1.0
12*3
17
100
0
12*3
16
100
0
结果总结
I型愈伤组织
Ⅱ型愈伤组织
Ⅲ型愈伤组织
不同培养基对怀地黄试管苗生长情况的影响
培养基 （mg/L)
MS+NAA 0.02
接种数 （瓶*株）
13*3
吲哚乙酸氧化酶活性测定
吲哚乙酸氧化酶活性的测定一、原理吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。
植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。
酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。
吲哚乙酸的含量可用比色法测定。
二、仪器及药品T6新悦型分光光度计离心机恒温水浴锅天平研钵试管移液管烧杯20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）。
1mmol/L2，4—二氯酚：称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配制成100ml。
1mmol/L氯化锰：称取MnCl2·4H2O 19.8mg用蒸馏水配制成100ml。
1mmol/L吲哚乙酸：称取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约90ml蒸馏水的容量瓶中(100ml)，稀释至刻度。
吲哚乙酸试剂A或B（任备其中之一）：试剂A：15ml 0.5mol/L FeCl3，300ml浓硫酸（比重为1.84），500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。
用时1ml样品中加入试剂4ml。
试剂B：10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。
用时于样品中加入试剂。
试剂B较试剂A灵敏。
三、操作步骤1．将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3梍4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。
2．取0.5g下胚轴，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml，置冰浴中研磨成匀浆。
再按100mg鲜重材料加0.5ml磷酸缓冲液的比例，用磷酸缓冲液洗涤研钵。
离心（4000r/min）10分钟，所得上清液即为粗酶液。
3．取试管2支，于一试管中加入氯化锰1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，酶液1ml，磷酸缓冲液5ml，混合均匀。
另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。
一起置于30℃恒温水浴中，保温30分钟。
处理MnCl22、4-二氯酚IAA(175ug/mL)酶液磷酸缓冲液(pH6.0)实验组对照组1111221564．吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂B 4ml，摇匀，置于30℃的黑暗处保温30分钟，使显色。
套袋对梨幼果生长发育的影响
・
８ ２・
山西师范大学学报 （ 自然科学版 ） 表 １ 不 同时期果实过氧化物酶（ Ｏ 的活性 （ Ｏ）０ ｍｎ・ ｇ Ｐ Ｄ） Ａ Ｉ７ ｉ ｍ ） ４／
Ｔ ｂ Ｔ ｅ ａ ｔ ｉ ｆＰ Ｄ ｎ ｔ ｅ ｆ ｉ ｏ ｅ ｒ ａ ｈ ｉ ｅｅ ｔ ｉ ａ ．１ ｈ ｃｉ ｔ ｏ Ｏ ｉ ｈ ｒ ｔ ｆｐ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒｎ ｍｅ ｖｙ ｕ ｔ ｆ ｔ
参 照 黄群声 等 的改进 方法 ．
２ 结 果 与 分 析
２ １ 套袋 对 果实 过氧化 物 酶 （ Ｏ 活性 的 影响 ． Ｐ Ｄ）
以愈 创木 酚作 为过 氧化 物酶 的底 物 ， 在有过 氧 化氢存 在 的条 件下 ， 氧化 物 酶 能使 愈 创 木 酚 氧化 ， 过 生 成茶褐色物质． 本实验采用比色法用分光光度计测量生成物 的含量． 测得过氧化物酶 的活性大小 ， 以每分 钟 Ｏ Ｄ变 化值表 示 ， Ａ Ｄ ｍｎ・ 即 Ｏ ／ ｉ ｇ鲜重 ． 结果 见表 １ ． 三 次连 续跟 踪 测 定 的 结 果 表 明 ，０天 后 过 氧 化 物 酶 （ Ｏ 活 性 较 ２ ３ Ｐ Ｄ） ０天 后 增 强 ， 袋 果 增 加 了 套 ６ ． ％ ， 照 果增加 了 ６ ．％ ．０天后 过 氧化物 酶 （ Ｏ 的活性 较 ３ ０４ 对 ３６ ４ Ｐ Ｄ） ０天后 减弱 ， 套袋 果 减弱 了 １ ．％ ， ７４ 对
指 标 的研 究 ， 了解 套袋对 酥 梨果 实初 期生 长发 育 的影 响．
１ 材料与方法
幼嫩 酥梨 果实 ， 采于 临汾 市襄 汾县 的鄢 里村 ， 实袋 为 单 层 塑 膜袋 ， 果 于幼 果 出现期 （ ５月 ６日） 在供 试
树上随机给单果套袋． 间隔一定天数 ， 分别采样．
植物生理学实验讲义最新
实验一植物组织渗透势的测定（质壁分离法）一、实验目的植物细胞的渗透势主要取决于溶液的溶质浓度，因此又称溶质势。
渗透势与植物水分代谢、生长及抗性密切相关。
在干旱、盐渍等条件下，一些植物常在细胞内主动积累溶质，以降低其渗透势，增加吸水能力，在一定程度上保持膨压，保持细胞的生长和气孔的开放，这种现象称为渗透调节作用。
渗透调节能力的大小可以用逆境条件下细胞的渗透势的降低值来表示，在水分生理与抗性生理研究中经常需要测定。
掌握质壁分离法测定植物细胞渗透势的原理和方法。
二、实验原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势，该溶液的浓度称为等渗浓度。
当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的溶液浓度。
带入公式即可计算出其渗透势。
三、实验材料、仪器设备和试剂1. 实验材料洋葱鳞茎（最好是紫色洋葱）2. 仪器设备光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、干净的小培养皿、滴瓶、吸水纸。
3. 试剂（1）1 mol/L蔗糖溶液，（2）蔗糖系列标准液以1 mol/L蔗糖溶液作为母液，配置梯度溶液: 0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.5、0.55、0.60、0.65、0.70 mol/L的蔗糖溶液。
四、实验步骤1. 取10套干燥洁净的小培养皿，编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。
2. 用刀片在洋葱鳞片外表皮或其它带有色素的组织表皮上纵横划成0.5cm2左右的小块，用镊子将表皮小块轻轻撕下，依次迅速投入各浓度蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料3个左右，使其完全浸没，并立即盖好皿盖。
浸泡10～15分钟。
3. 从0.70 mol/L 蔗糖溶液开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上载玻片，于显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的表皮做制片，进行同样观察，并记录质壁分离的相对程度。
酶的测定
一、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚比色法测定）酶液的制取称取0.5g鲜重叶片，加入1ml磷酸缓冲液（PH=7.8,0.05mol/L），冰浴研磨，研磨后再加入4ml磷酸缓冲液。
将研磨液倒入离心管中，平衡。
12000r/min、0-4℃下离心20min，上清液即为酶提取液。
离心后冷藏保存。
POD: 取上清液20微升加入比色杯中（对照加20微升磷酸），加3ml反应液，马上读470nm 下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0，1，2min的OD值）。
反应液：PH＝6.0的磷酸缓冲液50ml，加入愈创木酚28微升，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30％H2O219微升混合保存于冰箱中。
POD活性=ΔA470*V/（a*W）V-酶液总体积（ml）；a-测定时酶液体积（ml）；W-样品重（g）可溶性蛋白含量的测定取上清夜20微升（对照加20微升水），加3ml考马斯亮蓝，放置2min后，马上于595mn 下比色。
样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=（C*V/a）/(W*1000)C-查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V-提取液总体积（ml）；a-测定所取提取液体积（ml）；W-取样量（g）。
可溶性蛋白含量（ug）：y=0.0061x－0.0359（R2=0.9563）二、多酚氧化酶（PPO）活性测定（比色法测定）PPO活性的测定参照李焕秀（1994）的方法进行改进。
一、原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。
多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度，或用比色法测量产物的形成，常用的底物如邻苯二酚（儿茶酚）和多巴。
二、材料：树皮韧皮部（分别在压条育苗前期、愈伤组织形成期、根原基形成期和不定根生长期进行取样）三、仪器与用具：高速低温台式离心机；分光光度计；1mL 、5mL的移液管；5mL离心管；研钵；试管数支；10mL容量瓶；秒表；水浴锅；四、试剂：1、0.1mol·L-1，pH 6.0的磷酸柠檬酸缓冲液；2、1%（10g/L）的邻苯二酚（1g用蒸馏水定容至100 mL）；3、0.1%(1/L)的脯氨酸（0.1g（0.05）用蒸馏水定容至100 mL（50））；4、石英砂；五、方法步骤1、酶液提取取鲜样0. 5－1.0g, 加1 mL 磷酸柠檬酸缓冲液（0.1mol·L-1，pH 6.0），加少量石英砂，在冰浴中研磨成匀浆,加缓冲液9mL稀释（按100mg鲜重材料加1mL提取液的比例），使终体积为10mL（研完冰盘放回冰箱）。
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
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植物生理学模块实验指导
李玲主编
科学出版社
吲哚乙酸氧化酶的测定方法
【实验目的】
学习用比色皿法测定吲哚乙酸氧化酶
【实验原理】
吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶懂得作用下，被氧化破坏失去活性。
吲哚乙酸氧化酶活力的大小可通过其破坏吲哚乙酸的速度表示，用比色法测定吲哚乙酸的含量。
【器材与试剂】
1.实验仪器与用具
分光光度计、离心机、恒温水浴锅、天平、研钵、试管、移液管、烧杯
2.实验试剂
1mmol/L 2,4-二氯酚：称取16.3mg 2,4-二氯酚，用蒸馏水溶解并定容至100ml。
1 mmol/L氯化锰：称取19.8mg MnCl2·4H2O，用蒸馏水溶解并定容至100ml。
1 mmol/L吲哚乙酸：称取17.5mg IAA，用少量乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。
吲哚乙酸试剂：10ml 0.5 mol/L FeCl3，500ml 35% 过氯酸，使用前混合即可，不光保存。
用时将1ml样品加入2ml试剂。
20 mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）
3.实验材料
同过氧化氢酶
【实验步骤】
1. 称取植物组织材料鲜重1.0g，置于研钵中，加5ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆，再加入1ml磷酸缓冲液稀释，4000r/min离心20min，上清液为粗酶提取液。
2. 取试管2支，于1支试管中加入氯化锰1ml、2,4-二氯酚1ml、IAA2ml、粗酶提取物1ml、磷酸缓冲液5ml，混合。
3. 吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂4ml，摇晕。
在黑暗条件下，置于30℃恒温水浴中20min，使显色。
4. 将显色的反应液与分光光度计中测定530nm处的OD值。
根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量。
5. 配制浓度从0~30μg/ml的吲哚乙酸浓度，按照上述方法，分别测定OD值，绘制标准曲线或计算直线回归方程。
【实验报告】
按照下列公式，计算不同处理的材料吲哚乙酸氧化酶的活力（μg IAA/g鲜重·h）。
式中，C1为反应液中残留的酶IAA量（μg/ml）；C2为无酶提取液中的IAA量（μg/ml）；V1为样品制得的粗酶提取液体积（ml）；V为反应液中粗酶提取物体积（ml）；W为测试材料鲜重（g）；t为反应时间；10为反应液体积（ml）。
【注意事项】
制作标准曲线时，OD值在0.2~0.6时，测量的误差最小，所以当反应液浓度测定的OD 值大于0.6且接近1时，需要稀释后才能进行测定。
【思考题】
反应混合液与吲哚乙酸试剂混合后，为什么要在暗条件下对IAA进行显色反应？。