植物HSP70反义基因工程雄性不育表达载体的构建及鉴定

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【CN109868284A】植物雄性不育系统pAB及其构建方法和应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910142119.5(22)申请日 2019.02.26(71)申请人河北农业大学地址 071000 河北省保定市灵雨寺街289号(72)发明人吴立柱　王冬梅　马春英　安叶芝　(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465代理人李冉(51)Int.Cl.C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/20(2018.01)A01H 1/02(2006.01)(54)发明名称植物雄性不育系统pAB及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了植物雄性不育系统pAB，将S1序列、标记基因序列和S2序列插入植物表达载体构建得到，可利用该系统通过基因工程手段和分子辅助育种技术获得植物雄性不育材料，达到植物雄性不育的目的。

利用该系统创制的雄性不育株可作为常规杂交育种的母本与任意父本进行杂交组合，省去人工去雄的操作流程，进而大大节省人力和物力。

权利要求书1页说明书5页序列表4页附图5页CN 109868284 A 2019.06.11C N 109868284A权　利　要　求　书1/1页CN 109868284 A1.植物雄性不育系统pAB，其特征在于，将S1序列、标记基因序列和S2序列插入植物表达载体构建得到；所述S1序列如SEQ ID NO:1所示；所述S2序列如SEQ ID NO:2所示；所述S2序列包含特征序列“TGATTATAATGAGATATG”。

2.根据权利要求1所述的植物雄性不育系统pAB的构建方法，其特征在于，所述标记基因包括GFP基因和Bar基因。

3.根据权利要求1或2所述的植物雄性不育系统pAB的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)连接S1序列、标记基因序列和S2序列，得到目的片段；(2)目的片段插入植物表达载体，构建得到pAB。

pHSP70P-EGFP真核表达载体的构建及其在人Chang's肝细胞中的表达

pHSP70P-EGFP真核表达载体的构建及其在人Chang's肝细胞中的表达高峰;陈亚军;杨学文【摘要】目的构建HSP70启动子与绿色荧光蛋白重组真核表达载体,并在人Chang's肝细胞表达,建立一种新的体外药物肝毒性早期预测细胞模型.方法提取人Chang's肝细胞基因组DNA,钓取HSP70启动子基因,构建重组载体,经脂质体转染人Chang's肝细胞,用G418筛选稳定转染细胞,用荧光显微镜观察绿色荧光表达情况,用实时荧光定量PCR检测EGFP基因表达量的变化.结果成功钓取HSP70启动子基因并导入真核表达载体pEGFP-N1;G418以300 ng/mL的终浓度筛选出稳定转染的单克隆细胞;荧光显微镜观察到肝毒性药物酮康唑刺激人Chang's 肝细胞后,可诱导HSP70启动子调控增强型绿色荧光蛋白发出绿色荧光,药物刺激组EGFP mRNA相对表达量与正常对照组比较有统计学意义(t=-14.21,P<0.05).结论成功构建HSP70启动子与绿色荧光蛋白共表达真核表达载体,获得稳定转染单克隆细胞,并证实HSP70在肝毒性药物刺激下的应激表达,为建立新的体外药物肝毒性早期预测细胞模型进行高通量筛选新药奠定了基础.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)006【总页数】4页(P444-447)【关键词】热激蛋白;启动子;人Chang's肝细胞;基因重组【作者】高峰;陈亚军;杨学文【作者单位】江苏省中医院检验科,南京,210029;江苏省中医院检验科,南京,210029;江苏省中医院检验科,南京,210029【正文语种】中文【中图分类】Q78热激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是HSP家族中最重要的成员之一，属于诱生性HSP，在正常细胞中表达较少，但在应激状态下显著升高[1]。

增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是绿色荧光蛋白(GFP)的突变型，其发射出的荧光强度比野生型高6倍，更适合作为报告基因。

棉花HSP70基因的克隆与原核表达

棉花HSP70基因的克隆与原核表达刘娜;曲延英;陈全家;倪志勇【摘要】以抗旱性较强的棉花品种‘KK1543’为材料,采用RT-PCR技术克隆了1个棉花HSP70基因,命名为GhHSP70.研究结果表明:GhHSP70基因开放阅读框长1 997 bp,编码648个氨基酸,GhHSP70蛋白相对分子量为70.94 kD,等电点为4.83.氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,GhHSP70与欧洲大叶杨HSP70的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达到96.4％.为进一步分析基因的功能,构建原核表达载体pGEX-4T-1-GhHSP70,并在大肠杆菌中异源表达.SDS-PAGE分析表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致,重组蛋白在37℃,o.2 mmol/LIPTG诱导2h时表达量最大.研究为进一步研究棉花HSP70基因功能奠定基础.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2015(035)004【总页数】6页(P688-693)【关键词】棉花;热激蛋白70;基因克隆;原核表达【作者】刘娜;曲延英;陈全家;倪志勇【作者单位】新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786干旱是世界上危害最严重的一种自然灾害,是一个长期存在的世界性难题。

目前世界上有三分之一以上的土地处于干旱和半干旱地带,其他地区在植物生长季节也常发生不同程度的干旱[1],干旱影响植物各个阶段的生长发育和生理代谢过程。

棉花是关系国计民生的重要物资,是仅次于粮食作物的第二大农作物,其产值占中国经济作物的50%以上,在国民经济发展中具有重要地位[2]。

结核杆菌HSP70真核表达载体的构建

结核杆菌HSP 70真核表达载体的构建梁增伟李用国任红(重庆医科大学病毒性肝炎研究所,重庆,400010)摘要目的:构建结核杆菌HSP 70重组真核表达质粒。

方法:用PCR 方法从结核杆菌H37RV 基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因NDA 序列,应用T A 克隆技术,克隆到质粒GP EM G v ector,经DNA 测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒PCDN A3 1(+),构建成P CDN A3 1 HSP70重组质粒。

结果:经酶切鉴定,证实重组质粒构建正确。

结论:结核杆菌HSP 70真核表达载体构建成功。

关键词结核杆菌;热休克蛋白70;克隆;PCDNA 3 1中图分类号 Q 782 文献标识码:A 文章编号:1008-1836(2000)04-0001-06作者简介:梁增伟,男(1996-),博士生,讲师。

研究方向:乙型肝炎发病机理和乙肝疫苗结核病是一种由结核分枝杆菌(M ycobacterium tuberculosis,TB)感染引起的慢性传染病。

近年来,由于人们对结核病警惕性放松、贫困及流动人口的大量增加,以及耐药菌株、艾滋病的流行,结核病在世界各地出现大回升。

目前,我国仍然是结核流行最严重的国家之一,每年死于结核病的人数高居各类传染病之首。

尽管卡介苗(Bacille calmette Guerin,BCG)已广泛应用于结核病的预防,但仍未能阻止结核病的发展[1]。

经现场试验证实,在世界各地,BCG 的保护能力有明显差异。

因此,寻找更有效的结核疫苗是各国学者急需解决的问题。

热休克蛋白(Heat shock proteins,Hsps)是细胞在生物进化过程中为抵御恶劣环境而遗传下来的一组非常保守的蛋白质分子家族。

结核杆菌热休克蛋白70(TB.H SP70)是结核杆菌的主要抗原成分之一,具有免疫优势抗原(immunodominant antigens)的特性,可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生,并具有载体分子(carrier molecule)效应和免疫佐剂性质[2,3]。

转真姬菇热激蛋白HmHSP70基因烟草花粉败育的细胞学观察

转真姬菇热激蛋白HmHSP70基因烟草花粉败育的细胞学观察徐丽丽;郭立忠;陆秀华【摘要】采用扫描电镜和石蜡切片方法观察野生型烟草和转基因不育烟草的花药及其横切结构,研究真姬菇热激蛋白HmHSP70导致烟草雄性核不育的机理,结果表明:转基因不育烟草花粉的小孢子和花药壁发育异常,小孢子无法进行有丝分裂而降解,而绒毡层细胞和中层细胞过度分裂不降解,药室遭到严重挤压,是导致花粉败育的主要原因.【期刊名称】《青岛农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(033)001【总页数】4页(P16-19)【关键词】花粉败育;转基因烟草;石蜡切片;扫描电镜【作者】徐丽丽;郭立忠;陆秀华【作者单位】青岛农业大学生命科学学院,山东省应用真菌重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学生命科学学院,山东省应用真菌重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学生命科学学院,山东省应用真菌重点实验室,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】Q418雄性不育系在生产、生活中具有重要的应用价值。

根据遗传背景不同，可以分为细胞核不育、细胞质不育以及核质互作不育[1]。

细胞核雄性不育是由细胞核内染色体基因控制的雄性不育类型，细胞质雄性不育一般是植物在自然繁殖过程发生突变或者是通过品种间杂交而得到的不育性。

雄性核不育系可以通过毒素基因的特异空间表达、借助反义基因、影响小孢子发育、破坏胼胝质壁、转座子突变、组成型表达等途径获得[2]。

热激蛋白(Heat Shock Protein, HSP)又称热休克蛋白或热应激蛋白，是细胞或生物体在受到高温等逆境刺激时新合成的或含量增加的一类蛋白质，根据其相对分子质量、结构及功能可以分为5大类：HSP100，HSP90，HSP70，HSP60及小分子量热激蛋白sHSP家族[3]。

热激蛋白广泛分布于各种生物体内，是生物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，在抑制细胞凋亡[4]，延缓衰老，增强肿瘤免疫原性[5]，以及植物非生物胁迫环境的应答、抗病性、育性转换及植物发育中起着重要作用[6,7]。

文心兰HSP70_基因的克隆及表达分析

热带作物学报2020, 41(4): 745 754Chinese Journal of Tropical Crops文心兰HSP70基因的克隆及表达分析冯保云，李蓉，赖钟雄，林玉玲*福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州 350002摘要：为研究文心兰热激蛋白70基因（命名为OnHSP70）的分子特性及表达特点，以文心兰‘柠檬绿’（Oncidium hybridum ‘Honey Angel’）为材料，采用RT-PCR技术克隆OnHSP70，利用生物信息学方法分析其分子特性，通过qRT-PCR 技术分析其在不同组织及不同非生物胁迫处理下的表达特点。

生物信息学分析表明：该基因开放阅读框为1944 bp，编码647个氨基酸，翻译的蛋白为稳定蛋白，属于HSP70超家族，其蛋白二级结构由41.11%的α-螺旋、17.77%的延伸链、7.73%的β-转角和33.38%的无规卷曲组成，具有2个高度保守的功能域。

聚类分析表明：该蛋白与铁皮石斛和深圳拟兰的HSP70亲缘关系较近。

qRT-PCR分析表明：文心兰HSP70在4种不同组织器官中具有表达差异性，在花中的表达量最高；高温处理后基因的表达量明显上升；40 ℃高温胁迫4 h时表达量达峰值；茉莉酸甲酯及水杨酸处理时表达量呈现下调响应。

本研究为后期该基因功能研究及提高文心兰对高温的适应性提供理论基础。

关键词：文心兰；HSP70；克隆；非生物胁迫；表达分析中图分类号：Q786；Q949.718.43 文献标识码：ACloning and Expression Analysis of HSP70 in Oncidium hybridum FENG Baoyun, LI Rong, LAI Zhongxiong, LIN Yuling*Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, ChinaAbstract: In order to study the molecular characteristics of the heat shock protein gene (named OnHSP70) and its expression patterns in O. hybridum ‘Honey Angel’, OnHSP70 was cloned by RT-PCR, its molecular characteristics was analyzed by bioinformatics, and its expression patterns in different tissues and under different abiotic stress treatment were carried out by qRT-PCR. Bioinformatics analysis showed that the open reading frame of the gene was 1944 bp, encoding 647 amino acids, and the translated protein was a stable protein belonging to the HSP70 superfamily. The secondary structure of the protein consisted of 41.11% α-helix, 17.77% extended chain, 7.73% β-turn and 33.38% random coil, and had two highly conserved functional domains. Clustering analysis showed the protein had closely relative to HSP70 from Dendrobium catenatum and Apostasia shenzhenica. qRT-PCR analysis showed OnHSP70 differentially expressed in four tissues and the highest expression level was found in flowers; the expression of OnHSP70 gene increased significantly after high temperature treatment, and reached the peak under 40 ℃ for 4 h treatment; OnHSP70 showed down-regulated under methyl jasmonate and salicylic acid treatment. The study would provide a theoretical basis for studying the gene function and improving the adaptability to high temperature of Oncidium hybridum.Keywords: Oncidium hybridum; HSP70; cloning; abiotic stress; expression analysisDOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.016文心兰（Oncidium hybridum）是兰科（Orchi-daceae）文心兰属（Oncidium），又名吉祥兰、收稿日期 2019-07-10；修回日期 2019-08-25基金项目福建省高原学科建设经费（No. 102/71201801101）；福建省科技重大专项专题（No. 2015NZ0002-1）；特色园艺作物生物技术及产业化服务团队（No. 11899170112）。

芍药HSP70基因及其植物表达载体和应用[发明专利]

专利名称：芍药HSP70基因及其植物表达载体和应用专利类型：发明专利
发明人：陶俊,赵大球,夏星,苏江洪,魏梦苒,孙静
申请号：CN201710431200.6
申请日：20170608
公开号：CN107022553A
公开日：
20170808
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物工程领域，具体涉及芍药HSP70基因序列及其植物表达载体和应用。

所述芍药HSP70基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。

该基因可用于提高植物的耐高温能力和制备耐高温新种质。

本发明构建的芍药‘紫凤羽’PlHSP70基因植物表达载体可直接用于农杆菌介导的遗传转化，提高植物的耐高温能力、创制耐高温新种质。

申请人：扬州大学
地址：225009 江苏省扬州市大学南路88号
国籍：CN
代理机构：南京知识律师事务所
代理人：卢亚丽
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反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达

反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达王晓侠;李胜利;付员根;姚小宝;刘晖;宁小萱;刘志国;朱宏亮;樊代明【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2002(023)004【摘要】目的进行促凋亡治疗喉癌实验,构建和鉴定携带反义HSP70(heat shock protein 70)基因的真核表达载体.方法将HSP70 cDNA反向克隆入pcDNA 3.1,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AHSP70,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人喉表皮样癌细胞Hep-2,G418筛选阳性克隆;western blot和免疫组化检测转染前后瘤细胞的HSP70的表达.检测转染前后瘤细胞的生物学性状.结果获得pcDNA-AHSP70真核表达载体,HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的真核表达载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论本研究成功构建了反义HSP70真核表达载体并在人喉癌细胞得以表达.【总页数】5页(P344-347，413)【作者】王晓侠;李胜利;付员根;姚小宝;刘晖;宁小萱;刘志国;朱宏亮;樊代明【作者单位】西安交通大学第二医院院耳鼻喉科,西安,710004;西安交通大学第二医院院耳鼻喉科,西安,710004;汕头大学医学院生化与分子生物学教研室,汕头,515031;西安交通大学第二医院院耳鼻喉科,西安,710004;西安交通大学第二医院院耳鼻喉科,西安,710004;西京医院消化病研究所,西安,710032;西京医院消化病研究所,西安,710032;西安交通大学第一医院耳鼻喉科,西安,710061;西京医院消化病研究所,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】R733.71【相关文献】1.人野生型P53与反义mdm2基因融合体真核表达载体的构建及其在Mc3细胞中的表达 [J], 饶国洲;李晓红;李昂;郅克谦;张引成2.MAGE-1与人HSP70融合基因真核表达载体的构建及在小鼠黑色素瘤细胞内的表达 [J], 陈广生;隋延仿;叶菁;宋宏萍;黄亚渝;马加海;张秀敏3.pHSP70P-EGFP真核表达载体的构建及其在人Chang's肝细胞中的表达 [J], 高峰;陈亚军;杨学文4.人HSP70真核表达载体的构建及在大鼠胶质瘤细胞内的表达 [J], 谢万福;刘守勋;刘勇;王茂德5.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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ｓｅｉｔｆｐａｔｔｒｌｙｏｌｎ．ｉＫｅｒｓＨＳ０；ｇｙｗｏｄＰ７Ｏｓ６Ｂｒｍｏｅ；Ｃｌｎｉｅｒｇｐｏｔｒ￣ｆｅｇｎｅｉ；Ｍａｅｓｅｉｉ，ｅｎｌｔｒｔｌｙ
ＨＰ０热激蛋白是一种重要的“ 子伴侣 ” 白，由核Ｓ７分蛋它基因编码，进化上非常保守，同生物的ＨＰ０热激蛋白在不Ｓ７
ｍｏｒＯｓＢｆｒｃＳｃｌｎｄｏｔｇ６ｏｉｅＷａｏｅｏＰＣＲｅｏｎｃｅｔＰｏａｔｅｓｒｇｎｏｃｎｔｃＰｏａｉｎｅｅｐｅｓｏｅｔｒ．ｈｘｒｓｉｎｈｔｎｃｎｅｔｄｗｉＨＳ１ｎｉｎｅｆｍｅｔｔｏｓｒｔＨＳ１ｎｔｅｓｘｒｓｉｎｖｃｏＴｅｅｅｓｏｈｓａｕｓｐ
ｑｅｃｕｎｅ．ａｄｔｅｃｓｒｇｌｔｒｌｍｅｔｉｍｍｏｒａｅｎｈｉ・ｅｕａｏｙｅｅｎｎｐｏｔｒａｗａｎｅｒｔｄ．Ｐ７ｎｉｅｓｘｒｓｉｎｖｃｏｒｖｎｂｔｅｐｍｏｅｇ６ｗｓｃｎｒｄｂｓｉｔｇａｅＨＳ０ａｔｎｅｅｅｓｏｅｔｒｄｅｙｈｒｓｐｉｏｔｒＯｓＢａｏｆｅｙｉ
刘立２刘侯宁，春光，建南，会，科Ｌ，根齐，刘陈张文２樊颖伦，２吴冰洁２
（．１中国科学院遗传发育所，北京１００；．０１１２聊城大学生命科学学院，山东聊城￣２５）ｏ９
摘要［目的］为更好地研究ＨＰ０热激蛋白基因与植物雄性不育的关系。用ＰＲ方法克隆了水稻花药特异表达启动子ＯｇＢ，Ｓ７Ｃｓ６将其与设计合成的ＨＰ０义片段连接，Ｓ７反构建了由水稻花药特异表达启动子ＯｇＢ驱动的ＨＰ０义表达载体，，６Ｓ７反并进行了ＰＲ和酶切鉴定。Ｃ［结果］隆的ＯｇＢ启动子序列与所发表的序列同源性高达９％，动子区域的顺式调控元件完整；建的由水稻花药特异表达启动克ｓ６７启构子ＯｇＢ驱动的ｌＳＯ义表达栽体通过了茵落ＰＲ验证和表达载体值粒的酶切鉴定，体构建成功。［￣６ｔＴ反ＰＣ栽结论］该表达栽体的构建将
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安徽农业科学。ｕａｏＡｈｉ．ｃ．０８３（６：６８—６０ＪｒｌｆｎｕＡＳｉ２０。６１）６９任校对
卢瑶
植物ＨＳ０反义基因工程雄性不育表达载体的构建及鉴定Ｐ７
ｃｌｙＰＲａｎｌｉｓｏ．Ｃｎｌｉ］ｈｎｔｃｏｆｘｒｓｎｅｔｏｌｏｎｃｄｅｚＴｄｅｔｎ［ｏｃｓｎＴｅｃｓｕｔｎｅｉｃｒｕｓｉｆｎａｏｒｔｚｔｎｏｇｎｔｇｅｒｓａｏｎｙｉｇｉｅｕｏｏｒｉｏｅｓｏｖｏｗｄｐｏｄｏｄｔｎｆｉａｏｅｃｅｉｅｌｌｕｉｏｕｌｉｆｅｉｎｎ，ｍｅｉ
ＣｏｓｒｔｎｎＩｎｉｅｉｏｎｔｕｃｉａｄｄｅｔｆａｔｏｉ￣ｆ月叩ＯＡｎｌｅｅＲＮＡｘｅｓｔｓｎｓＥｐｒｓ￣
ＬＵ１ｅｌ（ｓｉｔｏｅｅｉｓｎｅｅｐｎａＢｏｏｙｈｎｓｃｄｍｙｏｃｅｃ，Ｂｉｎ０１１ＩＵ．ｔａＩｔｕｆｎｔｄＤｖｌｍｅｔｉｌ，ＣｉｅｅＡａｅｆｉｅｅｉｇ１００）ｎｔｅＧｃａｏｌｇＳｎｊＡｓａｔ［ｂｃｖ］ｒｒｏｔｙｈｌｉｔｅｈＳＴｎｄｍｌｓｒｉｐｎｆｔｒ［ｅｏｓＡｔｒｐｃｃｘｒｓｎｐ・ｂｔｃＯｊｔｅＩｏｅｔｓｄｔｒａｏｂｗｅｅＨＰＯｇｅｎａｅｌｏｌｔｒｅ．Ｍｔｄ］ｎｅｓｅｉｐｓｏｏｒｅｉｎｄｕｅｅｔｎｅｎｔｅａｅｔｉｙｆａｕｈｔｈｈｆｅｅｉｒｉ
ｖｃｒａｉｎｆｄｙＣｐｒｅｔｎｚｌｇｓｏ．ｒｓ］ｈｑｅｃｃｌｅ，６ｍｏｒａ９％ｈｍｌｙｔｂｉｅ・ｅｔｗｓｄｔｅＰＲｅｅｍｎａｅｙｌｄｅｉ［ｅｈＴｅｅｕｎｅｆｏｎｄＯｇＢｐｍｔｄ７ｏｏｇｔｈｐｌｈｓｏｅｉｂｉｘｉｄｎｌｉｔｎＲｕｅｓｏｏｏｈｏｏｅｕｓｄｅ
为植物基因工程雄性不育的利用奠定基础。关键词ＨＰ７；ｓ６Ｓ０ＯｇＢ启动子；因工程雄性不育基中图分类号Ｑ８文献标识码Ａ７２文章编号
０１ — ６１２ｏ）６Ｏ６８０５７６１（８１一６９ — ３ｏ
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