弗氏佐剂使用方法
胶体金标记物复溶稀释保存液简介
胶体金标记物复溶稀释保存液简介胶体金标记物复溶稀释保存液您了解多少?特殊提示：包括胶体金标记物复溶稀释保存液在内，本公司的全部产品仅可用于科研试验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途!产品名称：胶体金标记物复溶稀释保存液包装：100ML名称：弗氏佐剂规格：10ml|10ml*10弗氏佐剂是一种油包水的乳浊液，能够特别有效的诱导产生高滴度的抗体。
弗氏wanquan佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，可以加强对抗原的抗体反应。
佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。
简洁的说，这个注射入哺乳动物皮下之后，会产生炎症和痛苦。
弗氏佐剂是现在动物试验中常用的佐剂，分为不wanquan弗氏佐剂和wanquan弗氏佐剂。
不wanquan弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可依据需要而定，通常为2：1。
不wanquan佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为wanquan弗氏佐剂(FCA)。
储存条件：4℃名称：Cy5.5标记亲和素规格：100μg/200μg本制品以进口高纯度亲和素(Avidin)与进口花青染料5(Cyanine 5，Cy5.5)为原料，经化学交联获得高活性亲合素Cy5.5标记物。
本产品溶于PBS(pH7.3)中，蛋白浓度≥1mg/ml，含有稳定剂，可用于生物su及生物su化标记物的检测与分析。
本产品需经稀释方可使用，最佳工作浓度请自行优化。
亲和素(Avidin)又称亲合素，抗生wu素，是由4个分子量为16kDa的亚单位组成的糖蛋白，每单位可结合1ug的生物su(Biotin)。
由于亲和素与生物su的结合活性专一，亲和力强，因此在免疫检测中，经常将亲和素(A)与生物su(B)组成复合su(Complex，C)，既ABC法，以提高灵敏度。
保存条件：在-20℃或以下避光保存。
请勿反复冻融或于0℃以上久置。
名称：Cy5.5标记人血清白蛋白(HSA-Cy5.5)规格：100μg/200μg/500μg本制品以进口人血清白蛋白和进口花青染料5.5(Cyanine5.5，Cy5.5)为原料，采纳化学交联法制备的标记物。
单抗制备小鼠免疫SOP
单抗制备免疫一、材料准备：弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上每种抗原蛋白免疫小鼠4只靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。
抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。
二、实验步骤1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。
2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。
注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。
第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。
乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
将乳状液移入1ml注射器。
3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。
皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。
过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。
5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。
6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。
sigma弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂说明书
sigma弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂说明书生物商城 / 2011-02-08一、定义：弗氏佐剂（Freundadjuvant）,这是目前最常用于动物实验的佐剂，它是将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）等量混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温80）制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。
如在不完全佐剂中加入分枝杆菌（如死卡苗）则称为完全弗氏佐剂。
二、制备方法：弗氏佐剂是现在动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。
不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。
不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（FCA）。
一般首次注射时用1／2体积FCA 加上1／2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
如不加佐剂，则抗原量增大10-20倍。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，佐剂和抗原体积比一般为1：1，制备成"油包水"乳状液。
因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。
抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。
一般是每兔（约2kg重）或每羊（约20kg重）第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。
佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：（1）研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。
待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。
（2）注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
弗氏完全佐剂(complete
弗氏完全佐剂（complete freund’s adjuvant, CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete freund’s adjuvant, IFA）佐剂的作用：1．形成抗原储存库。
2．形成局部肉芽肿。
3．刺激淋巴细胞增殖和分化。
二、抗体特异性体液免疫是由抗体介导的免疫。
是人和动物的B细胞在抗原刺激下转化成浆细胞，并由浆细胞产生的具有与抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（Ig）。
存在于血液、淋巴液和组织液中。
（一）抗体的种类与结构抗体的种类多，血清中可有千百种不同的抗体，分为五种，已统一命名为IgG、IgM、IgA、IgD相IgE。
五种免疫球蛋白的分子结构基本相似（P257图9—9）说明。
(1)每个单体由两条长链又称重链(H链)及两条短链又称轻链(L链)构成。
各链之间以二硫键(S—S)相连接，两条L链位于两条H链所形成的Y形结构的两侧。
(2) 重链：每条H链分子量为55000，由420--460个氨基酸组成，重链共分四段，各段约含110个氨基酸。
靠近氨基(N—端)的第一段为重链可变区(V区)，简称VH，其余三段为恒定区(简称CH)，以CH1、CH2、CH3表示。
重链有γ、α、μ、δ、ε五种类型，每种抗体只能有一种类型的重链。
(3)轻链：分子量为22000，由2l3—216个氨基酸组成。
每条轻链分为两段：轻链可变区(简称v L)和轻链恒定区(简称C L)。
V L区有109个左右的氨基酸，CL区有l04个左右氨基酸。
轻链有两种类型，κ链和λ链。
一种抗体只能有同一种轻链。
(4)可变区：重链与轻链的可变区共同构成抗体结合价(即抗原结合簇部位)，与抗原呈特异性结合。
一个单体抗体分子具有两个结合抗原的部位，故为二价。
(5)用木瓜蛋白酶消化抗体，可得到三个片段：两个抗原结合片段，称为Fab，一个可结晶片段Fc；用胃蛋白酶消化，得到一个二价抗体活性部分，称F(ab’)2和两个剩余的小分子片段Fc’,不具任何生物活性。
兔抗制备方法
1. 取2 ml 的弗氏完全佐剂加到2 ml 的溶于PBS的纯化抗原中，使之乳化。
用3 ml 注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。
2. 将兔子敢在固定架上，用一只手抓住兔的颈背部毛皮，另一只手托住兔的后腿及臀部，将兔束紧固定以使后肢不能伸张，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，在后肢大腿肌肉内进针约1 cm 深，毎条大腿肌肉内最多注射0.5 ml 乳化液。
3. 四周后，用1 mg 的混溶干弗氏不完全佐剂的抗原乳化液（1：1）对兔进行肌肉内加强免疫注射，操作步骤同1和2，初次加强免疫后2周再次进行加強免疫注射。
4. 第二次加强免疫注射10天后，从兔的耳缘静脉处放血。
（1）先将兔固定在固定架上（固定紧），使其耳朵伸出，用70%乙醇洗洁消毒一侧耳朵。
（2）将兔耳置于热灯之下，用手指轻轻地拍打兔耳；1~2 min 内兔耳上的血管即会充分地充盈。
（3）用一消毒过的解剖刀的锋尖在兔耳缘静脉上迅速划一长约0.5 cm 的小口，收集兔血于50 ml 的塑料离心管中，直至伤口不再流血为止。
（4）使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。
5. 将兔耳擦拭干净，涂以70%乙醇，在耳朵伤口上涂一层凡士林，以减轻由乙醇产生的皮肤刺激感。
6. 将兔血在室温下静置数小时后置4 ℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻地挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血洧移到合适的离心管中，5 000 g 离心10 min，去除残留的红细胞及其他碎片。
7. 每两星期进行进一步的加强免疫。
每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。
8. 采用ELISA法或RIA法对血清中的特异性抗体进行滴度测定。
如果需要的话。
1. 按基本方案中步骤1制备免疫兔用的抗原。
2. 牢牢地抓住兔子，剃除其背毛，用70%乙酵消毒其暴露的皮肤。
用拇指和食指将需要免疫注射的区域的皮肤张开，用3 ml 注射器带24G注射针头以相对皮肤30。
小鼠免疫方案
小鼠免疫方案1.将抗原蛋白溶于生理盐水中（可以溶解为0.2mg/mL的抗原溶液）；1.1. 与等体积的弗氏完全佐剂双推法混匀（此时抗原浓度约0.1mg/mL）；1.2 经腹部皮下多点注射免疫BALB/C小鼠(注射约0.25mL)；1.3 2周后用等量抗原与不完全弗氏佐剂同上法混匀后免疫；1.4 再过1周后连续每周用以上1.3.的方法加强免疫1次(抗原可减半)，共3次；1.4 最后一次免疫3d后，可通过断尾取血测血清效价，若达到预期目的，即可放血收集抗血清。
2.20-100ug/mouse3.用正常小鼠的血清做阴性对照4.初步实验方案如下：小鼠眼球采血500ul，将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。
用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。
抗血清稀释度：1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：128001.抗原包被板子，10ug/ml,0.1ml/孔，4°包被过夜2、洗涤：每孔250ul洗涤液。
洗三次。
3、封闭：每孔200ul封闭液，37摄氏度1小时。
洗涤液,封闭液和包被液均是含0.1%吐温的PBST4、加入抗体，按比例稀释，每孔100ul，37度1小时。
5、洗涤：同上，5次。
6、加二抗：每孔100ul，37度1小时，洗涤5次。
（这部洗涤比较关键，必须洗干净，否则OD值偏高。
如果拍板熟练，也可以不用洗涤）7、显色：加入底物和供氢体。
分别50ul 避光显色15min8、终止：2mol/L硫酸50ul/孔9、测定：用酶标仪测450nm的OD 值。
弗氏完全佐剂对小鼠细胞免疫功能的影响
弗氏完全佐剂对小鼠细胞免疫功能的影响弗氏完全佐剂(CFA)是一种常用免疫佐剂，其提高体液免疫应答的作用已被公认，而对细胞免疫应答的影响鲜有报道。
作者测定了一些注射佐剂后小鼠的细胞免疫应答指标，同时测定体液免疫指标对CFA剂量作一监测，报告如下。
1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物昆明种小鼠24只，由本校实验动物室提供。
1.1.2主要试剂弗氏完全佐剂，为sigma公司生产。
1.2实验方法1.2.1CFA对小鼠产生抗卵黄抗体水平的影响昆明种小鼠24只，体质量18～22 g，雌雄随机分组，8只/组，以5倍稀释鸡卵黄为抗原。
免疫方法及程序见表1。
表1卵黄抗原免疫程序组别注射物第1天第4天第10天佐剂组佐剂(ml)0.2抗原(ml)0.20.2非佐剂组抗原(ml)0.20.2空白对照组生理盐水(ml)0.20.20.2注：以上均为背部皮下多点注射末次注射7 d后，将小鼠眼球取血并分离血清，用ELISA方法测定待检血清中抗卵黄抗体：鸡卵黄抗原5倍稀释包板，待检血清1∶10稀释，HRP-SPA按说明书配制。
1.2.2CFA对小鼠足跖肿胀的影响实验动物及免疫程序同表1，末次注射6 d 后每只小鼠右后掌皮下注射卵黄(5倍稀释)0.02 ml/只致敏，第2天测量其足的后掌至踝关节体积(ml)，并与小鼠自身左后足体积作对照，计算足肿率，如下：足肿率(%)=免疫后右足体积-自身左足体积自身左足体积×100%1.2.3CFA对小鼠碳粒廓清实验的影响昆明种小鼠16只，体质量18～22 g，雌雄随机分组，分为佐剂组与对照组，8只/组。
佐剂组小鼠腹腔注射CFA 0.2 ml/只，对照组腹腔注射无菌生理盐水0.2 ml/只，1 w后给2组小鼠分别经尾静脉注射20%墨汁0.2 ml/只，注射后1 min与5 min于小鼠眼球采血20 μl，置于2.0 ml 0.1%碳酸钠溶液中混匀，于680 ml波长下测定A值，并按如下公式计算K值：K=logA5-logA1[]T5-T1=[SX(]logA5/A1[]4[SX)]1.3统计分析数据均采用SPSS统计软件进行组间t检验，方差不齐时行t′检验。
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弗氏佐剂使用方法
弗氏佐剂是一种广泛应用于实验动物免疫接种的添加剂，能够增强疫苗的免疫原性，提高疫苗的效果。
在使用弗氏佐剂时，需要注意以下使用方法：
一、弗氏佐剂的分类与选择
1. 根据成分可分为油剂弗氏佐剂和水剂弗氏佐剂。
油剂弗氏佐剂主要包括油酸钠和胆固醇等，适用于油溶性抗原；水剂弗氏佐剂主要包括氢氧化铝和磷酸铝等，适用于水溶性抗原。
2. 根据剂型可分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。
不完全弗氏佐剂主要适用于初次免疫，添加比例一般为0.5%-5%；完全弗氏佐剂适用于加强免疫，添加比例一般为1%-5%。
二、弗氏佐剂的使用步骤
1.准备抗原：根据实验需要，制备相应浓度和纯度的抗原溶液。
2.配制弗氏佐剂：根据实验需求，将弗氏佐剂与抗原溶液混合，充分搅拌，确保抗原充分吸附。
3.免疫接种：将配制好的弗氏佐剂-抗原混合物接种到实验动物体内，如小鼠、大鼠等。
接种部位可选择腹腔、皮下、肌肉等。
4.观察与监测：在免疫过程中，定期观察实验动物的生长状况、疫苗反应等，以评估疫苗效果。
三、弗氏佐剂的注意事项
1.严格无菌操作：弗氏佐剂在使用过程中，应确保无菌操作，避免细菌污染。
2.适量使用：根据实验动物的体重、年龄等因素，合理控制弗氏佐剂的用量，避免过量导致不良反应。
3.观察动物反应：在免疫过程中，密切观察实验动物的反应，如食欲、精神状态等。
一旦发现异常，应及时处理。
4.储存条件：弗氏佐剂应存放在密封容器中，置于阴凉、干燥处，避免高温、潮湿。
总之，弗氏佐剂在实验动物免疫接种中发挥着重要作用。
正确选用和使用弗氏佐剂，可以提高疫苗的免疫效果，为实验研究奠定基础。
在使用过程中，要严格遵循使用方法，注意观察实验动物的反应，确保实验安全顺利进行。