实验一葡聚糖凝胶柱层析分离核黄素和牛血清蛋白
葡聚糖层析实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。
该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。
2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。
3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。
4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。
- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。
2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
葡聚糖凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结 构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富 于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网 眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼， 小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼 的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并 随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动， 从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒 的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝
7. 凝胶的洗涤及保存
由于凝胶对被分离的物质基本无吸附 作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液 冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶 颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以 使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装
柱。
凝胶暂时不用存放在4℃冰箱中； 若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠 （NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂；以 防发霉。凝胶长期不用，可用 乙醇 、 再用乙醚除乙醇，抽干即可， 在表面 皿上30℃逐步烘干。 我们所购置的该试剂100g,本科 生可使用３～４年。
色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚 糖–2 000 （Blue dextran–2 000） 通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否 整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱， 直至达到要求。
3. 平衡
装好的凝胶柱，使用前应该用相 当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流 过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。
4. 上样
将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程 称上样。 注意上样量的多少、样品的黏稠度等 因素。 “脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的 10%～25%。 生物大分子的分级分离，约为柱体积的 1%～5%。 样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2 倍以上，否则洗脱峰会变宽和歪斜。
胶
柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢； 大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不 能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶 颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、 流速快，比小分子先流出层析柱；小分 子最后流出。分子大小介于完全排阻不 能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质 分子，则居中流出。这样被分离物质即 被按分子的大小分开。
葡聚糖凝胶柱层析
4.2、凝胶的几种主要类型：
1、天然凝胶： 马铃薯淀粉凝胶、琼脂及琼脂糖凝胶 。
2、人工合成凝胶： 聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶 。
葡聚糖凝胶 的型号：
目前，凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶， 商品名称：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是 由右旋葡萄糖残基通过α－1，6糖苷键连接而成， 葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维 空间网状结构。
Fine SephadexG-25
Superfine SephadexG-50 Coarse SephadexG-50
Medium SephadexG-50
Fine SephadexG-50
Superfine SephadexG-75 SephadexG-75
Superfine SephadexG-100 SephadexG-100 Superfine SephadexG-150 SephadexG-150 Superfine SephadexG-200 SephadexG-200 Superfine
凝胶过滤介质 名称
SephadexG-10 SephadexG-15 SephadexG-25
Coarse SephadexG-25
Medium SephadexG-25
Fine SephadexG-25
Superfine SephadexG-50 Coarse SephadexG-50
Medium SephadexG-50
6
2
2~5
2~10 9~11
6
2
2~5
2~10 9~11
6
2
2~5
2~10 12~15
24 3
72
2~10 12~15
葡聚糖凝胶柱层析
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外。
亲水性
葡聚糖凝胶是一种亲水性凝胶，在 水中能够膨胀并保持稳定的结构。
分子筛作用
由于凝胶的网孔大小不同，不同大 小的分子在通过凝胶柱时的路径和 速度也不同，从而实现分子的分离。
柱层析分离原理
吸附与解吸
样品中的各组分在葡聚糖凝胶上 的吸附能力不同，通过选择合适 的洗脱液，可以实现各组分的分
离。
分子筛效应
4. 上样
5. 洗脱与收集
将待分离样品溶解在少量洗脱液中，沿柱 内壁缓慢加入，避免冲击凝胶表面。
开启恒流泵，以恒定流速进行洗脱，同时 用收集器按一定时间或体积收集流出液。
6. 检测与记录
7. 结果分析
对收集到的流出液进行适当稀释后，利用 紫外可见分光光度计或酶标仪等检测目标 物质的含量，并记录数据。
优点
分辨率高，操作简便，重 复性好，对样品的适用范 围广。
缺点
对于某些非水溶性物质或 极端条件下的分离效果不 佳，且分离过程中可能存 在吸附损失。
02 实验材料与方法
主要试剂与仪器
主要试剂
葡聚糖凝胶（如Sephadex G-25 、G-50、G-100等）、洗脱液（ 一般为缓冲液或盐水）、待分离 样品。
基本原理 • 实验材料与方法 • 葡聚糖凝胶柱层析在生物大分子分离中应
用 • 葡聚糖凝胶柱层析在药物分析中应用 • 葡聚糖凝胶柱层析在环境科学中应用 • 实验结果分析与讨论
01 葡聚糖凝胶柱层析基本原 理
葡聚糖凝胶结构与性质
三维网状结构
葡聚糖凝胶具有三维的交联网状 结构，这种结构允许小分子进入 凝胶内部，而大分子则被排除在
环境污染物检测与去除
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
凝胶层析分离核黄素和丙种球蛋白的实验流程
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☻葡聚糖凝胶（Sephadex） ☻琼脂糖凝胶（Sepharose）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
G型（G-X: X数字代表 交联度与吸水量） LH型
Sephadex的常见规格（分级范围）
型号 分离范围 (G-X) (分子量Da)
G10 G15 G25 G-50 G-75 G100 G150 G200 <700 <1,500
（四）洗脱、收集与检测
1、流速1滴/5-6秒不变，2ml/管收集 流出液，收集至流出液为无色。 2、用分光光度计，在280nm波长处， 以PBS调零，测定无色管吸光度；在 在450nm波长处，以PBS调零，测定有 色管吸光度。（每管收集液稀释1倍 后测定） 3、以管号为横坐标，吸光度为纵坐 标，绘制洗脱曲线。
（三）上样
1. 先将柱的出口打开，让PBS逐渐流出，待 液面与凝胶床面平齐时，关闭出口（注意： 不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用刻度吸管取样品混合液0.5ml，沿管壁小 心加于柱床表面，打开层析柱出口端，待 样品完全渗入胶内，开始收集流出液，同 时小心加洗脱液（PBS），
控制流速：1滴/5-6秒。（注意柱床上要不 断加PBS，保持1cm高水层）
六、思考题
1、凝胶层析的原理是什么？ 2、用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能
得到较好的分离效果？
实验一 葡聚糖凝胶柱层析法 分离核黄素和牛血清白蛋白
夏芳
2011-8-30
一、实验目的
了解：
层析技术的基本原理。
熟悉：
凝胶层析的操作过程。
掌握：
组分的洗脱与鉴定。
层析技术的基本原理
利用混合物中各组分的物理、化学性质 的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固 定相、流动相)中达到分离。
溶解度 分子极性 分子大小 两相 分子形状 吸附能力 分子亲合力等
2cm 砂芯
3. 将凝胶悬液（约40ml）沿玻璃棒小 心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉 积2cm高时，再打开出口，继续加入 凝胶悬液至凝胶沉积约8cm的高度即 可，关闭出口（要求凝胶床无气泡、 无断层、表面平整）。 4. 新柱装好后，加3-5倍体积PBS流过 柱床，然后平衡10min。（注意：始 终层析柱与水平面垂直）
分子筛效应
比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动速度快，首先流出。
较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
三、试剂、器材：
3.1 层析介质：Sephadex G-50； 3.2 样品（包含2个组分）： ①核黄素（黄色）， ②牛血清白蛋白， 上样量：0.5ml/柱。 3.3 洗脱液： 0.1mol/L,Ph7.2的磷酸盐缓冲液（PBS） 3.4 层析柱、分光光度计等。
层析的分类
（一）按两相所处的状态分类
气-固层析
气相层析
层析
液相层析
气-液层析 液-固层析
液-液层析
层析的分类
（二）按操作方式分类
1 1 2 2
柱层析
纸层析
薄层层析
3 4
层析的分类
柱层析（column chromatography） 将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随 流动相流动而得到分离的方法。
层析的分类
（三）按层析的分离机制分类
1. 吸附层析 2. 分配层析 3. 离子交换层析 4. 亲和层析 5. 凝胶层析
凝胶层析 (分子筛过滤、排阻层析)
混合物随流动相经固定相(网状孔径)的
层析柱时，混合物中各组份按其分子大
小不同而被分离的技术。
固定相（凝胶）
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔 网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细 微结构及筛孔的直径均匀一致。
物理 化学 性质
固定相
流动相
层 析
固定相(Stationary phase ) ：是色谱的基质， 可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子 交换剂等），也可以是液体物质（如固定 在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能 与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 交换等作用。
流动相(Mobile phase ) ：在色谱分离过程 中，推动固定相上待分离的物质朝着一个 方向移动的液体、气体等。
四、实验步骤
凝胶的溶胀
装柱
上样
洗脱、收集及测定
四、实验步骤
（一）凝胶的准备 称取Sephadex G-50 3g，臵于锥形瓶中， 加PBS约50ml，在沸水浴中加热2h溶胀 凝胶，用PBS漂洗，去除飘浮的细小颗 粒，冷却到室温后再装柱。
（二）装柱
1. 取层析柱，洗净，检查出口； 将层析柱固定在支架上，调 整层析柱与水平面垂直。 2. 关层析柱出口，先用约 10ml PBS预洗柱子，放出 洗液；再加PBS至2cm高， 然后关闭层析柱的出口。
1,000 ~ 5,000
应用
脱盐、短肽、小分子的分离
1,500~30,000
低分子量蛋白、多肽的分离
3,000~70,000 中低分子量蛋白、多肽的分离 4,000 ~150,000 中高分子量蛋白的分离 5,000 ~400,000 高分子量蛋白的分离 5,000 ~800,000
重点
二、凝胶层析的原理
五、实验注意事项
装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意 晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。
加样时吸管伸入柱内，接近液面处沿管壁加 入，动作要轻柔，不要将床面冲起。 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶 始终处Ⅰ 完全排阻的大分子
Ⅱ 中等分子 Ⅲ 完全渗透的小分子