酶学分析技术

同工酶的定义
是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同
的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位
基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。
一、同工酶产生的机理
（一）由不同基因位点编码 （二）由等位基因编码 （三）由多肽链化学修饰产生
二、同工酶的测定方法
（一）按照理化性质不同进行分离鉴定
1．电泳法 同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率 也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。 2．层析法
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶
类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶 联，通过Trinder反应加以测定。
四、底物浓度测定
利用酶催化反应的高效率和专一性，可以测 定底物浓度。与酶活性测定类似。
第三节 同工酶测定
同工酶的定义 同工酶产生的机理 同工酶的测定方法
表7-2
名
常用工具酶的名称及其缩写符号
称 缩写符号 名 称 缩写符号 HK CK PK GK LPL CE
乳酸脱氢酶 LDH 苹果酸脱氢酶 MDH 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD 谷氨酸脱氢酶 GLDH 葡萄糖氧化酶 GOD 胆固醇氧化酶 COD 磷酸甘油氧化酶 GPO 过氧化物酶 POD
己糖激酶 肌酸激酶 丙酮酸激酶 甘油激酶 脂蛋白脂肪酶 胆固醇酯酶 脲酶 肌酐酶
三、酶活性单位的计算
步骤：
明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位 定义确定物质量、体积和时间的单位，
运用公式进行计算。
计算公式:
产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×———————— 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）
（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定
（五）按照耐热程度不同进行鉴定
（六）选择性抑制法
第四节 酶学分析在临床诊断上的应用
血浆酶的来源 酶的区域化分布 酶活性测定在临床诊断中的应用 同工酶的诊断价值
一、血浆酶的来源
血浆特异酶 血浆酶 非血浆特异酶 细胞内酶 外分泌酶
二、酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的比率
根据米-曼氏方程可以计算 5.设计适宜的底物浓度
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶 活性，一般要求初速度达到最大速度的90%～95%、底物 消耗率为1%～5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不 致于使底物浓度过高而造成浪费。
(三)Vmax的应用
三、酶偶联测定法
应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测 定的酶促反应 。 Ex Ea EiABCP
式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测 定），Ex为待测酶，Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同， Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。
（一）酶偶联反应的原理
三、酶活性测定在临床诊断中的应用
（一）在肝脏疾病诊断中的应用 （二）在急性心肌梗死诊断中的应用 （三）在急性胰腺炎诊断中的应用 （四）在骨骼疾病诊断中的应用 （五）在肌肉疾病诊断中的应用 （六）在前列腺疾病诊断中的应用 （七）在肿瘤诊断中的应用
四、同工酶的诊断价值
第五节 酶活性测定最适条件的选择
2．Cornish-Bowden作图法 又称为直线线性作图法。
第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型
酶活性的测定方法
工具酶
酶偶联测定法 底物浓度测定
一、酶活性的测定方法
固定时间法
按照对酶 促反应时 间的选择 不同
连续监测法
（一）固定时间法
定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量 或产物的增加量。
第一节 酶活性测定的基本知识
酶活性的概念 酶活性单位
酶活性单位的计算
酶促反应进程
酶促反应底物动力学
一、酶活性的概念
酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时
间内底物的减少量或产物的生成量。
v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。
底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的 生成量为好。
二、酶活性单位
定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度 时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标 准。
惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。
国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下， 每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量，1Katal=60×106IU。
该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产 物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图 ，绘制反应速度曲线。
特点： 在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法 优点:
能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期， 结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。
缺点：
酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种
类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。
表7-1 某些酶的Km值
酶
乳酸脱氢酶 己糖激酶
底物
Km(mmol/L)
0.017 0.05 1.5 4.0 9.0 25 28 108
-半乳糖苷酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 蔗糖酶 糜蛋白酶
丙酮酸 D-葡萄糖 D-果糖 D-乳糖 H2CO3 H2O2 蔗糖 甘氨酰酪氨酰甘氨酸
2.反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。 3.选择酶的最适底物
Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底 物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物， 使酶促反应容易进行，并节省底物用量。
分类： 终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。
两点法：该方法反应时间的预定是从t1～t2 。
特点：
优点是简单。
缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。
注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分 钟为宜。
（二）连续监测法
定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。 原理：
可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。
2．过氧化物酶 POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨 基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物 质，反应如下： Trinder反应： POD 2H2O2 + 4-AAP + 酚 醌亚胺（红色） + 4H2O
（一）标本 （二）测定条件
底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、 激活剂和抑制剂
根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法 加以分离。
（二）按照底物专一性不同进行鉴定
同工酶底物专一性不同，Km值也不同。如果同工 酶之间的Km值差别足够大，可以通过测定其Km值加 以鉴定。
（三）按照最适pH不同进行鉴定
同工酶分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如 果同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓 冲溶液的pH值加以鉴定。
五、酶促反应底物动力学
中间产物学说：
酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催 化底物反应生成产物。E + S ES → E + P
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = ————— 〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
（一）米氏常数的定义 由米-曼氏方程可以导出： （Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
（二）Km值的应用 1.鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与
定义 ： Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。 应用：
Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子 酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反 应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的 转化率：
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）
(四)Km和Vmax的测定 1．Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法 1 Km +〔S〕 Km 1 1 —— = ————— = ——— · —— + ——— v Vmax〔S〕 Vmax 〔S〕 Vmax
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。
（二）常用指示酶及其指示反应
1．脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱 氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催 化下列反应： P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+
本章内容概要：
第一节
第二节 第三节 第四节 第五节
酶活性测定的基本知识
酶活性测定方法及酶学分析的类型 同工酶测定 酶学分析在临床诊断上的应用 酶活性测定最适条件的选择
本章教学要求：
1、掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位 的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果 的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用； 以NAD（P）H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用. 2、熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上 的应用。 3、了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定；同工酶测定和酶活性 测定最适条件的选择。