1、细菌的形态结构观察和染色
细菌的形态构造和观察--项目实训：革兰氏染色法
脱色：95%乙醇脱色20-30s, 至乙醇液不呈紫色
复染：番红复染1min,用水冲 洗
干燥后镜检
八、项目实训：革兰氏染色法
３ 染色结果
八、项目实训：革兰氏染色法
４ 染色影响因素
➢ 掌握好乙醇脱色程度，若脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时， 阴性菌被误染为阳性菌；
➢ 菌龄也影响染色结果，若细菌培养时间太长，已死亡或自溶，导致细胞壁通透性 的改变而呈现假阴性反应。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂 量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁， 酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。
项目一 细菌的构造和形态观察
八、项目实训：革兰氏染色法
１ 基本原理
八、项目实训：革兰氏染色法
２ 操作步骤
涂片、干燥、固定
初染：草酸铵结晶紫染色 1min,用水冲洗
微生物学基础
原核微生物的构造和形态观察
项目一 细菌菌鉴定的重要方法，可将全部细菌分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类； ➢ 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁化学组成和结构不同： G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因 脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能 被酒精脱色，仍呈紫色。
实验一细菌形态和结构观察，涂片制作及染色法.pdf
实验一 细菌形态和结构观察，涂片制作及染色法 课程名称：兽医微生物学 实验学时： 2学时一、目的要求1．了解、熟悉油镜的使用和使用原理。
2．掌握细菌抹片的制备及美蓝和革兰氏染色方法。
3．能够识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的染色特征。
4．熟悉细菌的基本形态学特征和特殊构造。
二、知识背景细菌个体微小，无色透明，在一般显微镜下不易识别，必须用适当的染料使其着色后，才能看到其形态、排列和结构。
某些细菌因有特殊的染色性，更可借特殊的染色方法加以鉴别。
因此染色技术是细菌鉴定中的基本技术之一。
检查微生物标本，需要使用显微镜。
比较多用的是普通光学显微镜。
根据不同要求，可使用暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜。
前几种显微镜用可见光线或紫外光线作照明光源，它们都属于光学显微镜；电子显微镜则是用电子流代替照明光源，与光学显微镜不同。
［普通光学显微镜的构造和使用］普通光学显微镜（或称生物显微镜）的构造，使用与保护方法，已在《组织学与胚胎学》教材中讲过，这里概述油镜的原理和使用要点：检查细菌标本，多用油镜进行，油镜是一种高倍放大（95-100倍）的物镜，一般都标有放大倍数（如95×；100×等）和特别标记，以便识别。
国产镜多用“油”字表示，国外产品则常用“Oil 或“HI”作记号。
油镜上还常漆有黑环或红环，而且油镜镜身比高倍镜和低倍镜长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。
油镜头的晶片细小，进入镜中的光量也较少，其视野比用高倍镜时为暗。
当油镜头和载玻片之间为空气层所隔时，因为空气的折光指数与玻璃的不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相似的油类，如香柏油等，使光线不致于因折射而大为损失，则可使视野充分照明，并能使操作者清楚地进行观察和检查（图l ）。
实验室中几种常用物质的折光指数 品名 玻璃 檀香油香柏油 加拿大树胶二甲苯 液体石蜡松节油甘油 水 折光指数 1.52-1.59 1.52 1.51 1.52 1.49 1.48 1.47 1.47 1.33进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度（升高集光器，开大光圈，调好反光镜等）。
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查是指通过观察细菌的形态、结构和大小来进
行分类和鉴定的方法。
常用的方法包括：
1. 显微镜观察，使用光学显微镜或电子显微镜观察细菌的形态
和结构。
通过放大细菌的形态特征，如形状、大小、细胞壁结构等
来进行分类和鉴定。
2. 染色法，常用的染色方法包括革兰氏染色、折射率染色、吉
姆萨染色等，这些染色方法可以使细菌在显微镜下更清晰地显示出
形态特征，有助于鉴定。
3. 形态培养特性，利用不同的培养基和培养条件，观察细菌在
不同环境下的生长特性和形态变化，如菌落形态、生长速度等。
4. 生化反应，通过观察细菌对不同生化试剂的反应，如碘试验、氧化酶试验等，来鉴定细菌的形态学特征。
5. 分子生物学方法，包括PCR、序列分析等技术，通过对细菌
的基因组进行分析，可以更准确地鉴定细菌的形态学特征。
综上所述，细菌的形态学检查常用的方法包括显微镜观察、染色法、形态培养特性、生化反应和分子生物学方法，这些方法可以从不同角度全面地观察和鉴定细菌的形态学特征。
实验一细菌的形态结构观察
实验一细菌的形态结构观察引言：细菌属于原核生物，是一类非常小的微生物，其形态结构一直是微生物学领域的重要研究内容。
通过观察细菌的形态结构，可以了解其生物学特性，甚至为细菌的分类和鉴定提供辅助依据。
本实验旨在通过显微镜观察、绘制不同种类细菌的形态特征，并对其进行描述和分析。
材料和方法：1.细菌样本：从环境中采集的细菌样本，使用无菌技术制备细菌涂片；2.显微镜：高性能光学显微镜；3.其他实验工具：无菌培养皿、无菌移液器、无菌盖玻片、无菌镊子等。
实验步骤：1.细菌准备：在无菌实验台上，取一块无菌盖玻片，用无菌镊子取一小滴待观察的细菌悬浮液在盖玻片上；2.细菌涂片制备：将另一块无菌盖玻片，倾斜放在含细菌悬浮液的盖玻片上，使两个盖玻片接触并自然扩散，制备细菌涂片；3.固定细菌：将细菌涂片在微火上加热，使细菌固定在玻片上；4.染色：将固定的细菌涂片浸入甲醇中进行固定，并在甲醇中静置3-5分钟；5.除染：将固定染色的细菌涂片置于水龙头下轻轻冲洗，冲洗到水清澈；6.贴片：将染好的细菌涂片倒置在无菌盖玻片上，用手指轻轻压实；7.观察：将贴好的细菌涂片放在显微镜下，逐个观察细菌的形态结构；8.绘制：选取有代表性的细菌形态，在实验记录本中进行绘制和注释。
结果和讨论：通过以上实验步骤，我们观察到了不同细菌的形态结构，如以下几个典型细菌的形态特征描述。
1. 球菌（cocci）：球形或近球形的单细胞菌，如葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
形态特征：球形，直径约0.5-1微米，聚集在一起呈葡萄状、串珠状。
2. 杆菌（bacilli）：长形的单细胞菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）。
形态特征：长棍状，直径约0.5-1微米，长度约2-6微米。
3. 弯曲菌（spirilla）：弯曲或螺旋形的细胞，如鲍曼不动杆菌（Vibrio cholerae）。
形态特征：螺旋形，直径约0.5-1微米，长度约2-6微米。
实验2 细菌的染色和形态观察
微生物学实验二
细菌的染色和形态观察
（验证性实验）
微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
上节课实验结果观察
显微镜油镜头的使用与保护
示教：细菌的基本形态与特殊结构的观察
操作：单染色、革兰染色 材料：葡萄球菌、大肠杆菌肉汤培养物 载玻片 2张 /人 1支/6人
教学目标
了解：
1.显微镜油镜镜头的使用与保护
革兰染色的原理：
等电点学说
化学学说 通透性学说
等电点学说：
革兰阳性菌的等电点（PI 2-3)比革 兰阴性菌的等电点(PI 4-5)低，在pH=7 的染液中，革兰阳性菌所带的负电荷比 阴性菌多，因而摄取碱性染料比较多且 牢固，不易被酒精脱色。
化学学说 ：
革兰阳性菌的细胞内含有某些特殊化 学物质，一般认为是核糖核酸镁盐，能与 染料和碘液结合成为稳定的化学物，不易 被酒精溶解脱色。
思考题
1. 革兰染色的过程如何？
2. 有时候革兰阳性菌被染成革兰阴性菌的色调，
这是为什么？
革兰染色的步骤
1：制片 3：固定 2：干燥 4：染色： 初染：结晶紫 1分钟
媒染：碘液
脱色：95%酒精
1分钟
半分钟
复染：稀释复红
半分钟
革兰染色结果判断
紫
球
碘
阳
酒
杆
红,
阴,
一
阳
一
紫
半
阴半Leabharlann 红脑 淋 卡，白 抗 胞 除外
革兰氏染色的意义：
将细菌分为革兰阳性、阴性两大类。
分析细菌的致病性。 指导临床用药。
革兰染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌 苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm 的膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、革兰染色过程： 初染：结晶紫 1分钟 媒染： 碘液 1分钟 脱色： 95%酒精 半分钟 复染： 稀释复红 半分钟 5、镜检：阳紫阴红 球阳杆阴
实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术
⑥ 复染：
已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。 复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以 复染也称为对比染色。 复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对 比作用。
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，
即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。
不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不
能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染 的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未 被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。
三、结果:
② 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时 也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞 、重金属盐或氧化剂等进行固定。
③ 媒染：
① 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。
• 若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；
• 若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中 央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳 浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面。
在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢 慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。
⑤ 脱色：
脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为 鉴别染色之用。
凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质 的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响 细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负 电荷，故可作碱性染料的脱色剂。
实验报告：细菌基本形态与结构
实验一细菌的形态与结构
一、实验目的
熟悉细菌的基本形态、基本结构、特殊结构
熟悉革兰染色的方法及意义
二、实验器材
示教玻片、显微镜、擦镜纸、
香柏油、二甲苯
三、实验步骤
1、细菌形态观察
（1）细菌基本形态
球菌：双球菌、链球菌、葡萄球菌
杆菌：炭疽芽胞杆菌、大肠埃希菌、结核分枝杆菌
弧菌：霍乱弧菌、幽门螺杆菌
（2）细菌特殊结构
荚膜、鞭毛、芽胞
2、革兰染色方法及意义
（1）方法
涂片→固定→结晶紫初染→碘液媒染→95%酒精脱色→复红复染
（2）结果
Ｇ＋菌：紫色Ｇ－菌：红色
（3）革兰染色法意义：
鉴别细菌；选择药物
四、实验结果
双球菌、链球菌、葡萄球菌，炭疽芽胞杆菌、大肠埃希菌，霍乱弧菌、幽门螺杆菌，荚膜、鞭毛、芽胞
试验日期。
1、细菌的形态结构观察和染色
奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜
荧光发射装置 摄像头 双筒目镜 镜筒 镜臂 物镜转换器 物镜 电源 载物台 视场光阑 载物台调节钮
光强调节钮 粗调节器 细调节器 镜座 孔径光阑
奥林帕斯生物显微镜的使用方法
1. 2. 3.
4.
5.
6.
7.
8. 8. 9.
10. 接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 11. 用低倍物镜，旋转粗调和微调 来进行对焦。 12. 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。 13.
实验一 结束
请交报告！
实 验 一
细菌的形态结构观察和染色
目的要求
观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理 及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽 孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。
安全事项
微生物 酒精灯
灭菌锅
玻璃器皿
超净台（紫外线）
电器（电炉、微波炉…） ……
实验材料 Ⅰ
(一)菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
(二)染液
1. 2.
简单染色：草酸铵结晶紫染液。 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 95％乙醇、蕃红染液。
实验材料 Ⅱ
(三)标本
细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。
(四)其他物品
无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。 肉膏蛋白胨培养基平板。
实验内容
（了解芽孢染色的方法和步骤）
孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴 水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀绿 饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿 使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色lmin， 水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈 现红色。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
思考题
(一)为什么必须用培养24h以内的菌体进行革兰氏染 色？
(二)要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操 作？哪一步是关键步骤？为什么？
实验一 结束
请交报告！
5. 用低倍物镜，旋转粗调和微调
作。
来进行对焦。
12. 观察完毕，下降载物台，取下载物台上
6. 调节双目镜筒间距和视度差。
的载玻片，将4×的目镜对准载物台，
7. 再适当调节照明度。
再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦
8. 8. 9.
使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。
镜纸沾取少量乙醇/水擦去残留的油， 最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。
13. 用毕复原：先将电压调节旋钮复原，关 闭主开关，切断电源。
显微镜保养和使用中的注意事项
1. 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2. 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 3. 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当
目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以 免压碎玻片或损伤镜面。 4. 光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤 害，并且无法进行图像采集。 5. 观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同 时聚焦。 6. 观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不 能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。
奥林帕斯生物显微镜的使用方法
1. 接通电源。 2. 打开主开关。
10. 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后， 下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油，
使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看
3. 转动光强调节钮，使亮度适中。 清物象为止。
4. 把标本固定在载物台上。
11. 换片：另换新片，必须从第9条开始操
实 验 材 料Ⅰ
(一)菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
(二)染液
1.简单染色：草酸铵结晶紫染液。 2.革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 95％乙醇、蕃红染液。
实验材料Ⅱ
(三)标本
细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。
(四)其他物品
无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。
4．水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。
5．复染 加美蓝染液染lmin。
6．水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成 蓝色。
实验内容
（了解芽孢染色的方法和步骤）
孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴 水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀 绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染 液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色 lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营 养体呈现红色。
实验内容
(三)简单染色(只做金黄色葡萄球菌)。 (四)革兰氏染色法：大肠杆菌、枯草芽孢
杆菌和金黄色葡萄球菌。
实验报告内容
(一)画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。
微生物名称 大肠杆菌
形状 大小 含水程度 菌落颜色 透明度 与培养基结合程度 嗅味
枯草芽孢杆菌
金黄色葡萄球菌
(二)绘图：画出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形态 图。
染色剂和染色原理
微生物染色常用染料如下表：
实验内容
（简单染色的方法和步骤）
涂片
自然干燥 微火固定
染色l min 冲洗 吸干 镜检
实验内容
（革兰氏染色的方法 和步骤）
涂片，干燥、固定
草酸铵结晶紫染液染色lmin，用 水冲洗
用革氏碘液媒染lmin，用水冲去 碘液
用95％乙醇脱色10-30s，至乙醇 液不呈现紫色
实验内容
(一) 成片观察 (1)观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和
螺旋菌的形态。 (2)观察四联球菌的形态及排列方式。 (3)观察苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮
菌的荚膜的形态。
实验内容
(二)观察平板上的细菌菌落，识别大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌 的菌落特征。
注意菌落的形状、高度、大小、颜色， 是否湿润、光泽、透明度、边缘状况 等等。
实验一 细菌的形态 结构观察和染色
目的要求
观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理
及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽
孢、荚膜及鞭毛染色。
奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜
荧光发射装置 摄像头 双筒目镜 镜筒 镜臂 物镜转换器 物镜 载物台 电源 视场光阑 光强调节钮 粗调节器 载物台调节纽 细调节器 镜座 孔径光阑
实验内容
（了解鞭毛染色的方法和步骤）
1．载片的清洗：将载片洗净浸泡在95％乙醇中备用。 2．实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上
(斜面下部要有少量冷凝水)，连续移种3～4次，每次培养12～18h， 最后一次培养12～16h。 3．制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底 部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水滴中片刻， 将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，可再返转一次使菌液流 经面积扩大，然后放平，自然干燥。 4．染色（利夫森氏染色法） ：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟 后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜 及染液冲洗干净，自然干燥。 镜检镜检时应在涂片上按顺序进行观察，经常是在部分涂片区的菌体染 出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。 当光线由反光镜通过玻片
与镜头之间的空气时，由 于空气与玻片的密度不同， 使光线受到曲折，发生散 射，降低了视野的照明度。 若中间的介质是一层油 （其折射率与玻片的相 近），则几乎不发生折射， 增加了视野的进光量，从 而使物象更加清晰。
基本原理
(一)简单染色法原理 (二)革兰氏染色法原理 (三)抗酸染色原理 (四)芽孢染色原理 (五)荚膜染色原理 (六)鞭毛染色原理
蕃红染液复染lmin，用水冲洗
吸干并镜检
实验内容
（了解抗酸染色的方法和步骤）
1．制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80℃恒温水浴3h杀死菌体。取 菌悬液涂片，自然干燥。
2．染色 滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出 现，不断补充染液，加热8～10min，弃染液。
3．脱色 用3％盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。
实验内容
（了解荚膜染色的方法和步骤）
1．制片
加一滴6％葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合， 再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干 燥。 2．固定 滴加l～2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。 3．染色，冲洗 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。 有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。 无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不 着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。