医学分子生物学附加题

医学分子生物学附加题

反式作用因子中的DNA结合结构域：

a.螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix, HTH)：

至少有两个α螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成“转折”。一个α螺旋负责识别DNA的大沟，另一个

与DNA主链骨架非特异性结合。这类HTH蛋白以二聚体形式与DNA结合。

b.锌指(zinc finger)结构

一个α螺旋与一个反向平行β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成

配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA结合。

Cys2/Cys2锌指：Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys

c.亮氨酸拉链结构(basic-leucine zipper, bZIP)（图7-20，-21）

蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同

一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合形成拉链型二聚体。

该二聚体的氨基端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结

合。

d.螺旋-环-螺旋结构(basic-helix/loop/helix, bHLH)

羧基端100-200aa形成两个α螺旋被非螺旋的环状结构所隔开；氨基端是碱性区。该类蛋白形成同源

或异源二聚体后，通过它们的碱性区与DNA相结合。

e.同源域蛋白(homeo domains):分子中含有约60个氨基酸的保守序列，这些序列参与形成了DNA的结合区。C

端有螺旋-转角-螺旋（HTH）样结构。

生物技术四大支柱：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程。

原癌基因的激活机理：

1. DNA重排：a.插入具有高活性的启动子或增强子(内源性或外源性)，使原癌基因持久、过量地表达。染色体易

位是原癌基因DNA重排的典型例子

b.负调控区的失活或丢失

2. 基因放大：基因扩增，可导致基因过量表达。原癌基因扩增一般认为与恶性演进有关，未必是恶性早期的改变

3. 点突变

4. 其它调控的异常：反式（Trans）调控系统、转录后的调控异常

病毒基因组特点：

1.病毒基因组很小，且大小相差较大。

2.病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成。

3.多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成。

4.基因重叠：即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子

5.基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质。

6.形成多顺反子结构（polycistronie）。

7.除了逆转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体。

8.噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的。

HIV感染过程：

捆绑――当HIV病毒的gp120蛋白捆绑到T-helper细胞的CD4蛋白时，HIV病毒附着到机体的免疫细胞上。滤过性病毒核进入到T-helper细胞内部，并且病毒体的隔膜融合进细胞壁。

逆转录――滤过性病毒酶，即逆转录酶，将病毒的RNA转化为DNA；

集成――新产生的DNA被病毒整合酶运送到细胞核中，并嵌入到细胞的DNA。HIV病毒被称之为前病毒；

复制――细胞核中的病毒DNA利用细胞自己的酶分裂产生信使RNA（mRNA）。mRNA含有制造新的病毒蛋白的指令序列；

翻译――mRNA由细胞的酶运送出细胞核。然后病毒就利用自然蛋白生成机制来生成病毒蛋白和酶的长链分子；

组装――RNA和病毒酶在细胞边缘聚集。一种被称之为蛋白酶的酶将多肽切成病毒蛋白。

发育――新的HIV病毒粒子从细胞壁中收缩出来并打破环绕他们的细胞壁。这就是封装的病毒从细胞中分离出来的过程。

基因组：(genome):泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。携带生物体全部遗传信息的核酸量。

HBV的复制：

乳糖操纵子包括：

启动子（promotor, P）；

操纵基因（operator, O）；

结构基因（Z、Y、A）：分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透过酶、β-半乳糖苷乙酰基转

移酶

乳糖操纵子调控模型的主要内容：

①Z，Y，A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码；

②该mRNA分子的启动子（P）位于阻遏基因（I）与操纵基因（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和

透过酶基因的高效表达；

③操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp）,是阻遏物的结合位点；

④当阻遏物与操纵基因相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制；

⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因相结合，从而激发lac mRNA

的合成。

细菌染色体基因组结构的特点：

1. 形成类核（nucleoid）：

由一条环状双链 DNA 分子组成细菌的染色体，并相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域。类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋。

2. 染色体DNA通常与细胞膜相连：连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。

在 DNA链上，与 DNA 复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合。

3. 具有操纵子结构：结构基因为多顺反子，若干个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节，数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（ regulatory gene ）即调节子（regulon）所调控。

4. 结构基因都是单拷贝，rRNA基因为多拷贝，基因组DNA中不编码的部份所占比例比真核细胞基因组少得多,比病毒基因组多。

5. 不出现基因重叠现象：基因组中，编码顺序一般不会重叠。

6. 具有相同的基因（isogene）:编码同功酶（isoenzyme）。

7. DNA分子中具有各种功能的识别区域：这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序。

8. 具有终止子（termintor）：基因或操纵子终末的特殊顺序，可使转录终止、RNA聚合酶从DNA链上脱落，终止子有强、弱之分。强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为 polyT 结构，无需终止蛋白参与即可使转录终止。弱终止子也有反向重复序列，但无 polyT 结构，需要有终止蛋白（Rho因子）参与才能使转录终止。

9. 结构基因中无内含子：基因序列是连续的，因此在转录时不需要剪接加工，与真核生物不同。

RNA的加工成熟？

1 rRNA和tRNA的加工成熟

rRNA：分子内切割和化学修饰

tRNA：内含子切割和化学修饰

2 mRNA的加工成熟

5` 端加帽子；

3` 端加poly(A)；

RNA的剪接；

核苷酸的甲基化修饰

三种转录激活域

（1）酸性激活域

（2）富含谷氨酰胺的激活域

（3）富含脯氨酸的激活域

真核生物基因表达调控特点

A 真核基因表达调控的环节更多

B转录与染色质的结构变化有关

1. 间期核染色质:

异染色质hetrochromatin高度压缩,不转录;

常染色质euchromatin,较松散;其中10%为active chromatin.超螺旋松弛.

2.组蛋白能非特异性的阻遏转录.组蛋白为碱性,易与带负电的磷酸基结合,从而遮蔽了DNA分子.

3.非组蛋白具细胞组织特异性,能特异的去除组蛋白的阻遏作用,有利转录.

4.转录活跃区DNaseⅠ高敏位点的开放,有利于调控蛋白的结合而促进转录

5.DNA甲基化能阻碍转录因子与DNA特定位点的结合, 影响转录.

C以正性调控为主

真核启动子对RNA聚合酶亲和力低,需要多种激活蛋白的协同作用.转录调控蛋白有激活,阻遏或二者兼有,但以激活为主.

D适应环境的瞬时调控是可逆的,而发育控制调控是不可逆的,决定细胞生长,分化,发育的全过程

重组体的筛选和鉴定

将重组质粒或重组噬菌体导入宿主细胞经初步扩增后，常利用遗传标记的表型特征和重组子的结构特征来筛选和鉴定含有目的基因的阳性菌落。

（一）遗传标记表型特征筛选

1．抗生素抗性标记筛选

?因大多数质粒载体具有抗生素抗性标记（如Ampr 、Tetr等），当带有完整抗性基因的载体转化不具抗性的细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而能在含有抗生素的培养基上存活，而未转化菌不能存活。

但应注意排除未重组的空载体的转化菌。

2．双抗生素筛选法

?某些质粒载体如pBR322质粒中具有Amp和Tet 抗性基因，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列(在Tetr基因序列内)时，则此质粒由Tetr变为Tets 。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。

3．β-半乳糖苷酶基因失活筛选

?某些质粒载体带有lacZ'基因，该基因编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸(α-肽)，IPTG可诱导lacZ'基因的表达而生成α-肽，其能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现所谓的α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶活力。该酶能催化X-gal 形成蓝色菌落。

?当外源基因插入lacZ'基因中的MCS时，lac α-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选。

4．营养标记选择当细胞生物合成途径中某个酶的编码基因失活后，该细胞成为营养缺陷型，如导入细胞的重组DNA能弥补缺陷的基因，培养基中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组DNA的阳性细菌。

（二）重组子结构特征的鉴定

1．重组子大小鉴别

重组子含有外源DNA，分子量较原载体大，从挑选的菌落中分别提取重组载体DNA和原载体DNA，用一种限

制酶切后直接进行电泳，原载体DNA分子量较小、电泳迁移率较大；而重组载体DNA因分子量较大而迁移率较小。

DNA能弥补缺陷的基因，培养基中就不需补充有关的营养成分，由此可挑选出含重组DNA的阳性细菌。

2．酶切鉴定从少量培养的菌液中分别提取重组载体DNA和载体DNA，根据已知外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，只出现一条区带的是载体本身，而还多一条外源DNA区带的是重组载体。可根据DNA mark来分析插入DNA片段的分子量。

3．PCR法提取重组子DNA，利用插入外源基因两端互补的特异引物，对重组子DNA进行PCR扩增。能扩增的即为含有外源基因的重组子。

4．核酸杂交法将重组子DNA的酶切片段电泳后,经变性从琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素膜上，应用特异性的核酸探针对其进行杂交，通过放射自显影,可鉴定阳性克隆。也可通过菌落的原位杂交筛选阳性克隆。

基因在医学中的应用

基因诊断目前应用最多的是：

症状前诊断（疾病易感性）。

产前诊断（羊水、脐带血、绒毛膜）遗传性疾病。

着床（植入）前诊断。

临床诊断（国外已用于乳腺癌、结肠癌等）。

意义：

优生优育

确定与疾病有关状态（如易感性、抗药性、发病类型及阶段）。

传染病早期（产生抗体前）诊断及病毒带有人检出。

分析基因型，使器官移植配型精确。

法医DNA鉴定。

人类基因组计划内容

?遗传图（连锁图）

?物理图

?序列图

?基因图

遗传图的含义：

?以具有遗传多态性的遗传标记为路标，以遗传学距离为图距的基因组图。

?遗传学距离：以重组分数表示

–A、B两点间的遗传距离由AB间平均发生交换与重组的次数决定，当AB间距较小时，两者间发生多次交换的可能性较小，其重组分数约等于遗传距离。反之，当AB间距较大时，两者间发生多次重组的

可能性也大，遗传距离也越大。

–单位：M、cM

物理图的含义

?以一段已知序列的DNA片段（sequence tagged site, STS)为路标，以Mb或Kb为图距的基因组图。

?内容

?测定人类基因组DNA分子的物理长度

?描述了DNA分子两个位点或染色体两个位标之间的实际距离

?单位：核苷酸数

序列图

?策略：

–把庞大的基因组分成若干有路标的区域后，进行测序分析

–序列分析需要用一个区域的DNA片段重叠群使测序工作不断延伸，这中间的STS被用作任何两个片段（上百个bp）间的重叠区域，使分别被测的短序列进行正确的拼接

–基本策略是建立DNA小片段的重叠群并尽可能地降低重叠部分所占的比例以提高效率和降低成本基因图

?内容：鉴别出占据基因组序列2-5%的全部基因的位置、结构与功能

?方法：从mRNA到染色体的位置

?原理：

–生物性状和疾病由蛋白质决定；

–蛋白质均由mRNA编码；

–mRNA通过反转录酶合成cDNA；

–用较稳定的cDNA（或EST）作为“探针”进行分子杂交，鉴别出与转录有关的基因。

?EST：根据mRNA的特点，用寡聚T（oligo dT）或克隆载体的相关序列为引物，对mRNA的双端尾侧的几百个bp进行测序，得到EST（表达序列标签）。