青少年特发性脊柱侧凸椎体软骨终板核心蛋白和细胞因子的变化

作者单位：１００７３０中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院骨科（徐宏光现调入安徽芜湖皖南医学院弋矶山医院骨科）!!青少年特发性脊柱侧凸（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｓｃｏｌｉｏｓｉｓ，ＡＩＳ）的发病原因不明，机械性异常、生长发育异常、神经肌肉性因素、结缔组织异常、基因表达异常、黑色素、生长激素异常等均被认为在脊柱侧凸的发病中起着一定的作用，但均无定论。

在临床上ＡＩＳ患者侧凸范围内的椎体存在着不同程度的楔形变，随着侧凸程度的加重，椎体的楔形变则更为明显。

软骨终板是位于椎间盘与椎体间的一层薄的透明软骨，人体发育过程中椎体的生长需通过软骨终青少年特发性脊柱侧凸椎体软骨终板核心蛋白和细胞因子的变化・临床研究・徐宏光邱贵兴王以朋吴志宏仉建国刘勇!!【摘要】目的了解青少年特发性脊柱侧凸患者顶端椎凸、凹侧椎体软骨终板内核心蛋白、ＴＧＦβ１及ｂＦＧＦ的变化，探讨其在特发性脊柱侧凸发病中的作用。

方法１２例患者，男４例，女８例；年龄１２～２０岁，平均１４．９岁；侧凸Ｃｏｂｂ角４３°～１０２°，平均６５．１°。

所有患者均经Ｘ线、ＣＴＭ和（或）ＭＲ检查排除先天性、神经肌肉性等原因所导致的侧凸。

对前路手术取下的顶椎和端椎的软骨终板进行Ｓ－Ｐ法免疫组化染色，染色结果采用北京航空航天大学图像中心医学彩色病理图像分析系统进行分析。

结果经非参数Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩和检验，侧凸顶椎和端椎凹侧终板软骨细胞内ＴＧＦβ１表达的面密度和数密度高于凸侧及顶椎凸侧表达的数密度高于端椎均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；侧凸顶椎和端椎凹侧ｂＦＧＦ表达的面密度和数密度高于凸侧亦有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；顶椎及端椎凸侧蛋白多糖核心蛋白的面密度和数密度高于凹侧，但无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。

ＴＧＦβ１及ｂＦＧＦ及核心蛋白在侧凸顶椎的表达较端椎表达略高，但无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。

结论青少年特发性脊柱侧凸患者凹侧ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦ高表达和核心蛋白低表达，表明细胞因子和核心蛋白的表达异常可能是脊柱侧凸的发病原因或继发于侧凸的变化。

【关键词】脊柱侧凸；转化生长因子β；成纤维细胞生长因子２；免疫组织化学Ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｔｈｅｖｅｒｔｅｂｒａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｅｎｄｐｌａｔｅｏｆａｄｏ－ｌｅｓｃｅｎｔｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｓｃｏｌｉｏｓｉｓＸＵＨｏｎｇ－ｇｕａｎｇ，ＱＩＵＧｕｉ－ｘｉｎｇ，ＷＡＮＧＹｉ－ｐｅｎｇ，ｅｔａｌ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒ－ｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７３０，Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ１，ｔｈｅｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｏｎｔｈｅｃｏｎｖｅｘａｎｄｃｏｎｃａｖｅｓｉｄｅｓｏｆａｐｅｘａｎｄｅｎｄｖｅｒｔｅｂｒａｌｃａｒｔｉｌａｇｎｏｕｓｅｎｄｐｌａｔｅｉｎａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｓｃｏｌｉｏｓｉｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｒｅｗｅｒｅ１２ｃａｓｅｓｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ４ｍａｌｅｓａｎｄ８ｆｅｍａｌｅｓ．Ｔｈｅａｇｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓａｔｔｈｅｓｕｒｇｅｒｙｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ１２ｔｏ２０ｙｅａｒｓ（ｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ１４．９ｙｅａｒｓ）．ＴｈｅＣｏｂｂａｎｇｌｅｒａｎｇｅｄ４３°ｔｏ１０２°（ｍｅａｎ，６５．１°）ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｓｃｏｌｉｓｉｓｗａｓｍａｄｅｂａｓｅｄｏｎｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ，ＣＴＭａｎｄ／ｏｒＭＲＩｔｏｒｕｌｅｏｕｔｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ，ｎｅｕ－ｒｏｍｙｅｐｕｔｈｉｃａｎｄｏｔｈｅｒｓｃｏｌｉｓｉｓ．Ａｌｌｐａｔｉｅｎｔｓｕｎｄｅｒｗｅｎｔａｎｔｅｒｉｏｒｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ＴｈｅｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃｏｎｖｅｘａｎｄｃｏｎｃａｖｅｓｉｄｅｏｆｔｈｅｒｅｓｅｃｔｅｄａｐｅｘａｎｄｅｎｄｖｅｒｔｅｂｒａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｅｎｄｐｌａｔｅｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｗｉｔｈＳ－Ｐｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ１，ｔｈｅｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｗｅｒｅａｌｌｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓｅｎｄｐｌａｔｅ．Ｗｉｔｈｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｅｒＷｉｌｃｏｘｏｎｒａｎｋｔｅｓｔ，ｔｈｅａｒｅａｄｅｎｓｉｔｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｄｅｎｓｉｔｙｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ１，ｔｈｅｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｏｎｔｈｅｃｏｎｃａｖｅｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅａｐｅｘａｎｄｅｎｄｖｅｒｔｅｂｒａｅａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｌｅｖ－ｅｌｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｃｏｎｖｅｘｃｕｒｖｅａｔｔｈｅａｐｅｘａｎｄｅｎｄｖｅｒｔｅｂｒａｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｏｎｔｈｅｃｏｎｖｅｘｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅａｐｅｘａｎｄｅｎｄｖｅｒｔｅｂｒａｅｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｎｔｈｅｃｏｎｃａｖｅｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅａｐｅｘａｎｄｅｎｄｖｅｒｔｅｂｒａｅ（Ｐ＞０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＧＦβ１ａｎｄｂＦＧＦ，ｗｈｉｌｅａｌｏｗｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｏｎｔｈｅｃｏｎｃａｖｅｓｉｄｅ，ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔａｐｏｓｓｉｂｌｅａｅｔｉｏ－ｌｏｇｉｃａｌｆａｃｔｏｒｏｒａｓｅｃｏｎｄａｒｙｃｈａｎｇｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＡＩＳ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｓｃｏｌｉｏｓｉｓ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ；Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２；Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ板的软骨内骨化来完成［１］，其与椎体的纵向生长密切相关，对于软骨终板在侧凸中的变化迄今文献研究较少。

细胞因子体内外的研究表明，其可调节软骨细胞的增生和分化，在体内可介导细胞间的相互作用，与细胞的生长发育、再生及创伤的愈合有关，但其在侧凸患者软骨终板内的表达如何迄今尚未见报道［２］。

为此，我们选择北京协和医院骨科收治的年龄１０岁以上并排除先天性、神经肌肉性等原因所导致的脊柱侧凸及成人脊柱侧凸患者，对手术切除的软骨终板进行免疫组化染色，研究细胞因子和蛋白多糖核心蛋白的变化，以探讨软骨终板在ＡＩＳ发病中可能的作用。

资料与方法一、一般资料本组１２例，男４例，女８例；年龄１２～２０岁，平均１４．９岁；侧凸Ｃｏｂｂ角４３°～１０２°，平均６５．１°。

根据ＰＵＭＣ分型［３］，ＰＵＭＣⅠａ４例，ＰＵＭＣⅠｂ３例，ＰＵＭＣⅡｂ１１例，ＰＵＭＣⅡｄ１２例，ＰＵＭＣⅢ２例。

所有患者均经Ｘ线、ＣＴＭ和（或）ＭＲ检查排除先天性、神经肌肉性等原因所导致的侧凸。

二、标本取材选择ＡＩＳ前路手术中切取的顶椎的上下终板及上端椎的下终板和下端椎的上终板，生理盐水洗涤后将标本置入１０％中性甲醛，４℃下固定４８ｈ，梯度酒精脱水后石蜡包埋。

三、常规组织学检查石蜡切片，厚度为５μｍ，苏木素－伊红染色（ＨＥ染色）了解软骨终板的组织形态学变化。

四、免疫组化染色采用Ｓ－Ｐ法免疫组织化学染色，所有免疫组织化学染色步骤均按生产厂家推荐条件并结合中国医学科学院基础医学研究所病理教研室实验方法进行。

ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦ单克隆抗体试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，核心蛋白单克隆抗体（ａｂ２５０１）购自英国ａｂｃａｍ公司，免疫组化用的其它试剂亦购自福州迈新生物技术开发公司。

包埋的蜡块切片，厚度为５μｍ，经脱蜡、水化，ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦ免疫组化染色时以热修复（微波修复）抗原，核心蛋白免疫组化染色则以α胰蛋白酶（０．０００１ｍｇ／ｍｌ）和ＣａＣｌ２（０．００１ｍｇ／ｍｌ）ＴＢＳ液修复抗原，以３％过氧化氢灭活内源性过氧化酶，按Ｓ－Ｐ法染色要求逐步滴加一抗、二抗，ＤＡＢ显色，阳性为软骨细胞胞浆呈棕黄色着色，苏木素复染，脱水，封片。

实验中选择ＰＢＳ代替一抗作阴性对照。

以显微镜下终板软骨细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

采用北京航空航天大学图像中心医学彩色病理图像分析系统进行分析，随机取镜下５个视野（×１０），计算５个视野下的平均阳性细胞面密度（阳性目标总面积／统计场总面积）和数密度（阳性细胞总个数／统计场总面积），单位为μｍ。

五、数据处理由于总体资料呈偏态分布，用中位数（四分位数）Ｍ（Ｑ）表示免疫组化结果。

采用非参数Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩和检验，以ＳＰＳＳ１０．０统计软件进行数据处理，&值取０．０５。

结果侧凸程度较轻者终板软骨外观无明显异常，侧凸Ｃｏｂｂ角大于７０°者终板外观呈白色，凹侧的软骨终板较凸侧薄。

常规组织学检查（ＨＥ染色）镜下显示所取标本均为软骨组织，软骨存在明显的退变征象，部分伴有灶性钙化。

随机在高倍镜下（×４０）选择５个视野下计算软骨细胞的平均数，软骨细胞数为（１５±６）个（ｘ±ｓ）。

ＨＥ染色镜下观察显示发育不成熟（Ｒｉｓｓｅｒ征０～Ⅲ，月经未来潮）及侧凸轻的患者，软骨细胞的密度明显高于侧凸程度较重者及发育成熟（Ｒｉｓｓｅｒ征Ⅳ～Ⅴ及月经初潮２年以上）的患者。

非参数Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩和检验，侧凸顶椎和端椎凹侧终板软骨细胞内ＴＧＦβ１表达的面密度和数密度高于凸侧及顶椎凸侧表达的数密度高于端椎均有统计学意义（Ｐ＜０．０５，图１，表１）；侧凸顶椎和端椎凹侧ｂＦＧＦ表达的面密度和数密度高于凸侧亦有统计学意义（Ｐ＜０．０５，图２，表２）；顶椎及端椎凸侧蛋白多糖核心蛋白的面密度和数密度高于凹侧，但无统计学意义（Ｐ＞０．０５，图３，表３）。