第8章 霉菌毒素的检测
酶联免疫吸附法(ELISA)检测霉菌毒素
酶联免疫吸附法（ELISA）检测霉菌毒素霉菌毒素主要是指霉菌在其所污染的食品或是饲料中产生的有毒代谢产物，在饲料的加工、运输和贮存过程中都可能会产生。
据统计，已知的霉菌毒素有300多种，常见的毒素有：黄曲霉毒素，玉米赤霉烯酮/F2毒素，赭曲毒素，T2毒素，烟曲霉毒素，赭曲霉毒素，呕吐毒素，麦角毒素等。
霉菌毒素污染多为复合型，饲料中大多存在3种以上的霉菌毒素污染。
霉菌毒素通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。
因此，霉菌毒素的检测必须引起重视，防患于未然。
1霉菌毒素检测方法饲料中霉菌毒素检测方法主要有目测法，薄层色谱法（TLC），高效液相色谱法（HPLC），酶联免疫吸附法（ELISA），放射免疫法（KIA）及快速试纸检测法。
其中酶联免疫吸附法（ELISA）此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
经过三四十年发展，ELISA技术已经作为一个成熟的快速筛选方法，应用于不同的行业，美国USDA，EPA将众多ELISA的方法作为官方快速筛选方法。
2酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法（ELISA）的基本原理是，在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合成酶标记抗体抗原复合物，在酶底物的参与下，复合物上的酶催化底物使其水解成为另一种带色物质，其核心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色深浅来进行分析。
该法优点突出，1）灵敏度高，干扰小：抗体抗原的免疫反应特异性很强，结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小。
2）操作简便快捷：由于特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，同时测定时间短。
3）安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂贵的测定仪器，且所用试剂也相对较少，毒素标准品的浓度可以很低，减少了对检测人员和环境的潜在危害和污染。
尤其适用于大批量样品的快速测定。
3试剂盒ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
食品中霉菌毒素的测定(修订)
食品中霉菌毒素的测定:目前的分析方法及其局限性摘要：霉菌毒素是由一系列真菌产生的自然污染物。
它们出现在食物和饲料当中对人类和动物的健康造成了威胁。
这种威胁是通过直接污染农产品或喂养的动物受污染的干草、玉米而“遗留”在动物的代谢产物-牛奶和鸡蛋中的真菌毒素引起的。
由于他们不同化学结构和不同的物理属性,霉菌毒素显示出广泛的生物效果。
个体霉菌毒素可以导致基因毒性、诱变、致癌、致畸和产生雌激素。
为了保护消费者的健康和减少经济损失，监督和控制食品和饲料中的霉菌毒素已经成为生产商、监管部门和世界范围内的研究人员一个主要的目标。
然而,化学结构的多样性使霉菌毒素无法用单一的技术进行分析。
因此,大量的分析方法已被开发和验证。
食物基质的多相性及快速的需求同准确测定多种霉菌毒素，对常规分析带来了巨大的挑战。
本文将讨论的最关键的问题是：（1）代表性样本的收集（2）基于色谱或免疫化学技术的新兴分析方法和经典分析方法的操作（3）官方方法的验证（4）当前方法的局限性及未来的发展前景关键词：霉菌毒素和真菌代谢产物、食品、快速验证的方法、规则、抽样、多样霉菌毒素的测定介绍：常规的霉菌毒素自古以来,人类使用真菌(霉菌,酵母)生产食品,包括奶酪、面包,意大利香肠、啤酒和葡萄酒。
神秘的疾病与食品消费作为结合体从而导致第一个为食品的立法和检查食品质量体系的成立。
最古老的食品立法是巴比伦人(公元前1700年)和希泰族(公元前1500年)颁布的。
两个具有历史意义的立法已经为我们现代食品法律处理了两个重要的目标：保护健康和预防欺诈。
然而,1961年之后真菌代谢产物不再被认为是潜在的健康危害。
关键事件是1963年英国在进口了被黄曲霉毒素污染的花生之后导致了100000只火鸡的死亡。
随后,有很多可疑事件都与使用霉菌毒素的生化战争试剂有关。
1974年和1981年之间,目击者报告从老挝,阿富汗和柬埔寨难民的暗示指出空袭期间使用了通过空气分散的单端孢霉烯族毒素类细菌。
霉菌和毒素的检测方法 ppt课件
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2.1.4.1 结果
计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相 应稀释倍数计算。
若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的 平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落 数乘以最高稀释倍数计算。
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自从20 世纪 60 年代发现强致癌的黄曲霉毒素以 来,霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视。我国 在2011 年颁布了国家标准 GB2761-2011食品中真菌毒 素限量,各级食品监督检测机构全面开展霉菌的检测工 作。
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62.1霉菌检测方法01 方法GB4789.15-2010 食 品微生物学检验霉 菌和酵母计数。
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2.1.5 镜检
B.1 检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为 1.3447～ 1.3460（即浓度为7.9%～8.8%），备用。 B.2 显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率 90～125 倍调节标 准视野，使其直径为 1.382 mm。 B.3 涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的 摊布于计测室，以备观察。 B.4 观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测， 一般每一检样观察 50 个视野，同一检样应由两人进行观察。 B.5 结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准 视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测 微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计， 其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。
霉菌毒素检测方法
霉菌毒素检测方法1.呕吐毒素(DON)的检测ELISA法测试前请仔细阅读本说明在2—8℃冷藏—不要冻结1.简介 DON毒素脱氧瓜萎镰菌醇（DON，）是单端孢菌素烯烃中的一种，它通常是由生长在谷类物品（如小麦、玉米、大麦和秣草）霉菌镰红菌素生成的。
脱氧瓜萎镰菌醇的毒性效应包括：呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病。
研究表明猪对脱氧瓜萎镰菌醇很敏感。
当脱氧瓜萎镰菌醇含量≥1ppm时，它们就拒绝进食。
其毒性也会对其他物种产生毒性效应，各种物种对脱氧瓜萎镰菌醇的敏感性各不相同。
研究表明脱氧瓜萎镰菌醇会使已加工食物发生问题，包括使可吃的谷类制品产生臭味、对生面团质量产生负面影响。
因此，精确测定可能含有脱氧瓜萎镰菌醇的食物和食品就现得十分重要。
FDA（美国食品和药品管理局）已经制定了脱氧瓜萎镰菌醇含量的强制标准。
美国食品药物管理局已经颁布的DON毒素建议限量如下：2.方法原理本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppm级的DON毒素。
样品和标准控制液中游离的DON毒素与轭合物中的DON毒素竞争抗体结合位置。
清洗后，加入底物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明DON毒素越少。
将其置于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中DON毒素的准确浓度。
3.贮存要求本试剂盒存放在2～8℃时，可以一直使用到标签上注明的到期日期。
4.试剂与仪器4.1已提供的材料48个包被了抗体的孔；48个红色标记的混合孔；5瓶2ml浓度为0、0.25、0.5、1、3 ppmDON毒素控制标准液(黄色标签)；1瓶DON毒素-HRP轭合物溶液(兰色标签)；1瓶24ml底物溶液(绿色标签)；1瓶32ml红色终止液（红色标签）4.2需要但未提供的材料提取材料；蒸馏水或去离子水；100ml量筒；150ml的具塞三角瓶；滤纸；样品收集具塞试管；漏斗；粉碎机；称量为5～25克的秤；带450nm滤光片的酶标仪；200μl移液器；200μl吸咀；纸巾或等效的吸水材料；计时器；防水记号笔；洗瓶；移液器用的试剂槽；蒸馏水或去离子水；计时器等5.注意事项本测试盒不使用时应在2～8℃下存放。
畜禽饲料中霉菌毒素的检测
2018年第7期霉菌毒素具有很多种类,并在自然界中广泛分布,常会污染饲料。
当霉菌污染饲料后就会导致其含有大量的霉菌毒素,从而能够导致畜禽发生中毒死亡,或者导致畜禽的免疫机能降低,长时间处于亚健康状态,生产性能下降,引起免疫失败,并经常发病,还可经由肉、蛋、奶等食物链危害人类健康,实际工作中应该注意采取相应的检测手段。
1主要霉菌毒素饲料、油籽、谷物以及加工的粮食容易污染霉菌,特别是在温度超过25℃,相对湿度达到80%以上时,通风较差以及阴雨季节,更容易污染。
在饲料原料或者饲料中常见的霉菌主要是曲霉菌、镰刀菌和青霉菌。
这些霉菌通常可产生黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、单端孢霉烯(T-2毒素)、呕吐霉素、腐马菌素、串珠镰刀菌素等。
这些霉菌及其产生的毒素常会导致饲料中的常用原料被污染,如曲霉菌分泌的黄曲霉毒素B1(A FB1)、黄曲霉毒素B2(A FB1)、黄曲霉毒素G1(A FG1)以及黄曲霉毒素G2(A FG2),是导致大部分数动物发生霉菌毒素中毒的主要原因;青霉菌属中的多个菌种分泌的赭曲霉毒素,对家禽具有十分强的毒力,且常与黄曲霉毒素一起污染饲料。
每种霉菌或者霉菌毒素基本不会单独存在,常是同时存在2种或者多于2种,多种毒素共同产生的毒性作用会明显大于任何单一毒素产生的毒性,普遍将这种作用称为霉菌毒素的相乘作用。
动物吸收霉菌毒素后会进入血液,并通过血液循环输送到全身各处,甚至是侵入胎盘。
2常用的检测方法在畜禽饲养过程中,如果出现减少采食,饲料结块谷物和饲料发热,颜色变暗,以及散发出较小异味等情况,就可怀疑饲料可能发生霉变。
饲料及其污染霉菌的菌丝体能够纵横交织,编织成菌丝蛛网状物,这种结构导致饲料形成结块。
在肉眼观察发现这些菌丝网状物之前,菌丝体就已经在饲料中大量生长繁殖,由此说明其中已经含有霉菌毒素。
因此,判断饲料发生霉变一种最简易实用的方法就是饲料存在结块。
不同霉菌菌落会形成的特有形态,并具有不同的生物学特征,通过光学显微镜观察能够进一步确认。
饲料中霉菌毒素的检测及控制措施
饲料中霉菌毒素的检测及控制措施作者：李雅丽来源：《现代畜牧科技》2018年第06期摘要：霉菌毒素具有很多种类，并在自然界中广泛分布，往往会污染饲料。
当霉菌污染饲料后就会导致其含有大量的霉菌毒素，从而能够导致畜禽发生中毒死亡，或者导致畜禽的免疫机能降低，长时间处于亚健康状态，生产性能下降，引起免疫失败，并经常发病，还可经由肉、蛋、奶等食物链危害人类健康，应注意检测。
关键词：饲料；霉菌毒素；肉眼观测；显微镜检测；酶联免疫吸附法；荧光检测法；薄层层析法中图分类号：S816文献标识码：B文章编号：2095-9737（2018）06-0052-011 霉菌毒素种类饲料、油籽、谷物以及加工的粮食容易污染霉菌，特别是在温度超过25℃，相对湿度达到80%以上时，通风较差以及阴雨季节，更容易污染。
在饲料原料或者饲料中常见的霉菌主要是曲霉菌、镰刀菌和青霉菌。
这些霉菌通常可产生黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、单端孢霉烯（T- 2毒素）、呕吐霉素、腐马菌素、串珠镰刀菌素等。
这些霉菌及其产生的毒素往往会导致饲料中的常用原料被污染，如曲霉菌分泌的黄曲霉毒素Bl（ AFBl）、黄曲霉毒素B2（ AFBl）、黄曲霉毒素Gl（ AFGl）以及黄曲霉毒素G2（ AFG2），是导致大部分数动物发生霉菌毒素中毒的主要原因；青霉菌属中的多个菌种分泌的赭曲霉毒素，对家禽具有十分强的毒力，且往往与黄曲霉毒素一起污染饲料。
2 常用检测方法肉眼观测。
在畜禽饲养过程中，如果出现减少采食，饲料结块谷物和饲料发热，颜色变暗，以及散发出较小异味等情况，就可怀疑饲料发生霉变。
饲料及其污染霉菌的菌丝体能够纵横交织，编织成菌丝蛛网状物，这种结构导致饲料形成结块。
在肉眼观察发现这些菌丝网状物之前，菌丝体就已经在饲料中大量生长繁殖，由此说明其中已经含有霉菌毒素。
因此判断饲料发生霉变一种最简易实用的方法就是饲料存在结块。
显微镜检测。
不同霉菌菌落会形成的特有形态，并具有不同的生物学特征，通过光学显微镜观察能够进一步确认。
霉菌毒素的测定方法完美版PPT
用目测法或酶标仪B1标准样比较判断样品中B1的含量。
用目测法或酶标荐仪B赭1标准曲样比霉较判毒断样素品中AB的1的含周量。摄入量不得超过100 ng／奴体重。目前，部分国家已
⑥万一手皮膜被污染，可用次氯酸纳溶液搓洗，再用肥皂水洗净。
4 ng是各实验室制所公定认的了。 食品及饲料中赭曲霉毒素A的限量标准，我国尚未制定。赭曲霉毒
知识点：霉菌毒素的测定方法
情景7：食物中有毒有害成分的检测 任务4：食品中黄曲霉毒素的测定
课程：食品分析技术
食品中有害物质的测定
有害物质－霉 素
第三节 食品中霉菌毒素及其检测
二、霉菌毒素的检测
1．黄曲霉毒素的检测
我国涉及黄曲霉毒素的限量及检测的国家标准有 GB 2761—1981(食品中黄曲霉毒素B1允许量标准)、 GB 9676--1988(牛乳及其制品中黄曲霉毒索M，限量卫生标准)、 GB／T 17480--1998(酶联免疫吸附法测定饲料中黄曲霉毒素B、)、 GB／T 5009．22--1996[薄层色谱法(第一法)／ELISA(第二法)测定食品中黄曲霉毒
④实验中所用的或被污染的玻璃器皿须经5％次氯酸钠溶液浸泡5分钟再清洗之。 ⑤实验完毕应用5％次氯酸钠清洗消毒实验台等。 ⑥万一手皮膜被污染，可用次氯酸纳溶液搓洗，再用肥皂水洗净。
2．赭曲霉毒素A的检测
用目测法或酶标仪B1标准样比较判断样品中B1的含量。
霉菌毒素检测方法综述
•霉菌毒素检测方法综述由于产生毒素的霉菌无处不在，以及我们对大多数有利于霉菌生长和霉菌毒素产生的条件控制不力，造成食品和饲料的霉菌毒素污染问题越来越成为现代农业生产中不可忽视的重大难题。
在各种农产品上生长着的各种各样的霉菌，这些霉菌都能产生霉菌毒素，霉菌毒素是有毒的化合物，有些甚至是致癌的。
霉菌毒素有很多种(CAST,2003)，包括黄曲霉毒素，主要是黄曲霉毒素B1和M1(Aflatoxins，FB1、FM1)；赭(棕)曲霉毒素A(OchratoxinA，OA)；杂色(柄)曲霉毒素(Terigmatocystin)；展青霉素(Patulin,PTL)；玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN(F－2));串珠镰刀菌素(Moniliformin,MF)，三硝基丙酸以及属于单端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)的T－2毒素(T－2toxin,T－2)；脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)(Deoxynivalenol,DON)；二乙酰镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol，DAS)等。
联合国粮农组织在近期的报道中指出，全世界至少99个国家，占世界人口的87％，针对粮食和饲料的霉菌毒素污染问题都有相关的规定。
在未来的几年里，与不断变化的全球气候有关的气象突发事件的增多将进一步向我们提出挑战。
霉菌毒素污染给食品企业、粮油加工企业、畜禽养殖场以及饲料的加工企业造成了巨大的经济损失。
目前霉菌毒素检测常用的方法如下几种：一、薄层层析法：TLC法是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。
TLC 法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，在展开时影响斑点的荧光强度。
二、色谱法：色谱法，包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱等，一直是最重要的霉菌毒素的化学分析方法。
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样品用乙腈-水（50+50） （碳酸盐缓冲液调pH至
8.0）振荡提取
过滤，滤液用 0.1%的BSA洗
液稀释
加样品后，加抗AFTB1 单克隆抗体，37℃孵育
后，洗去多余抗体
包被抗原包被酶标板， 4℃过夜后洗去多余抗原
加辣根过氧化物酶标记 的羊抗鼠IgG ，37℃孵 育后，洗去多余抗体
加底物四甲基联苯 胺溶液， 37℃孵育
定量
以0.04μg/ml 的AFTB1标准使用液10 μl 作定量基准，样品液稀释到此浓度
（荧光强度相当）进行计算
最低检出量法
酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay) 是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
测定 定性
定量
3.确证实验
喷MBTH•HCl溶液， 130℃烘烤15min，冷
却后365nm下观察
薄层扫描外标法
第四节 DON和NIV的检测
DON和NIV溶于水、 甲醇和乙醇，热稳定。
请同学们按照前面的图绘出DON和NIV 的薄层色谱展开前后的可能结果
样品处理
样品加正己烷和 甲醇-水（55+45）
振荡提取
滤液水浴挥干、冷却， 用苯-乙腈（98+2）溶
解残渣作点样液
取甲醇-水 层，用三氯
甲烷萃取
三氯甲烷层用 无水硫酸钠脱
水、过滤
测定
定性
1.检查AFTB1
2.检查AFTB2a
365nm，Rf值0.6，
加TFA水解
蓝紫色荧光点
AFTB1， Rf值0.1
后硫酸终止反应
包被抗原 AFTB1 底物
AFTB1单克隆抗体
辣根过氧化物酶标 记的羊抗鼠IgG 杂质成分
酶标板
酶标板
酶标板
酶标板
酶标板
第二节 赭曲霉毒素A的检测
赭曲霉毒素是一类化学结构和性质相近 的化合物，现已分离鉴定出4种，其中 赭曲霉毒素A（OTA）是最主要的。
微溶于水、石油醚，酸性条件下溶于苯、 三氯甲烷和稀碳酸氢钠溶液，碱性条件 下成盐并溶于水；在紫外线照射下会分 解。
样品处理
样品加三氯甲烷 和0.1mol/L磷酸振
荡提取后过滤
滤液加碳酸 氢钠溶液振
荡萃取
取三氯甲烷层水浴挥干， 用苯-乙腈（98+2）溶
解残渣作点样液
取水层用稀盐 酸调pH2-3，加 三氯甲烷萃取
测定 定性
1.横展除杂
2.纵展定性
365nm 黄绿色荧光点
测定 定性
3.确证实验
喷碳酸氢钠乙醇溶 液，365nm下观察
定量 最低检出量法
第三节 展青霉素的检测
展青霉素溶于水和乙醇，在碱性溶液中 不稳定，在酸性溶液中较稳定，耐热。
样品处理鲜果、果酱源自果汁、果酒加无水硫 酸钠研磨
加乙酸乙酯 振荡浸泡
少许三氯 甲烷定容
取乙酸乙酯层 减压浓缩近干
过滤，滤液加稀 碳酸钠溶液振荡
测定 定性
1.横展
2.纵展
254nm，Rf值0.35 黑色斑点
基本原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过
酶与底物产生颜色反应进行定性与定量。抗原或抗体 均可作为测定的对象。
方法特点 具有操作简单，分析通量大、快速，特异
性强，分析灵敏度高等特点。 3种必要的试剂
1 固相的抗原或抗体
2 酶标记的抗原或抗体
3 酶作用的底物
【主要仪器与试剂】
1 移液器 2 酶标仪 3 洗板机 4 酶标板 5 试剂盒
第八章 霉菌毒素的检测
第一节 黄曲霉毒素的检测
黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构和 性质相近的化合物，现已分离鉴定出20 种以上。
难溶于水、乙醚、石油醚等，易溶于甲醇、 三氯甲烷、苯、乙腈等。 TLC法检测定位和定性
在紫外线照射下可发出荧光。
在强酸性和碱性溶液中不稳定，对氧化剂也
不稳定。
TLC法的确证检测