核小体及其提取技术
核小体结构
一、核小体的基本结构核小体是真核染色质最基本的重复结构单元，除了成熟的精子之外。
它们是真核DNA 最小的打包结构，细胞核内染色体最基本的结构，在控制基因表达方面有着很重要的作用。
它们大概由146个DNA的碱基对以及四对被称为组蛋白的蛋白质组成，当用电子显微镜观察的时候，它们就好像是成串DNA上的水珠。
Don、Ada Olins以及Roger Kornberg在1974年提出的核小体假设是了解真核状态基因表达的一个范例。
组成核小体的蛋白被称为组蛋白H2A, H2B, H3和H4，它们是组成核小体的核心结构，环绕着它们DNA被包裹起来，而组蛋白H1位于核小体的底部，与核小体DNA和连接DNA相互衔接的地方，并沿着DNA延伸到衔接的部位。
通过电子显微镜观察破裂的间期细胞流出的染色质,可以看到染色质纤维呈非连续性颗粒状,就像一条细线上串联着许多有一定间隔的小珠,这些小珠状颗粒被称之谓核小体。
通过酶学方法及对颗粒成分的化学分析，核小体的面目才得以展现。
用一种能使DNA降解的小球菌核酶(micro coccal nuclease)处理提取的染色质,可以得到单个的核小体颗粒.也就是说,这种核酸内切酶将颗粒之间的细线──"裸露"的DNA切断了.在一定酶切条件下,颗粒中所包含的DNA长度总是稳定在200bp左右.DNA片段大小通过凝胶电泳很容易鉴定出来.对染色质进行部分酶解处理,使之产生一系列不同长度的DNA片段,结果发现这些片段之间有一个共同的"阶差",而此"阶差"值恰好等于单个核小体的DNA片段大小,即200nbp左右。
从上述结果不难看出,每个核小体中包含200bp左右DNA片段.以密度梯度离心法制备核小体单体,对其中的蛋白质进行化学分析得知:每一个单体中含有H2A、H2B、H3和H4各二分子(它们构成一个八聚体),H1一分子.而从核小体多聚体、三聚体、四聚体等)获得的分析结果是:相邻多聚体之间的DNA"阶差"等于核小体单体中的DNA长度(200bp左右),且多聚体分子量总是单体分子量的整倍数.通过对多种真核染色体的研究都验证了这一事实,从而得出了核小体是染色体的基本结构单位的结论.核小体重复单位是在所有真核生物中具有普遍意义的染色体基本结构,不同生物(或同种生物的不同细胞)的核小体,其DNA片段长度的有所差别,一种细胞通常有特定的平均值,一般为180--200bp.每一核小体所含的DNA与组蛋白的量大致相等.二、核小体的功能染色体的包装实际上是指细胞核DNA在双螺旋基础上的进一步结构变化,巨大的DNA 链要包装成染色体需经多层次的结构变化才能实现.这些结构变化总的看是更高层次的超螺旋形成.上面讨论的核小体,可视为染色体DNA的一级包装,即由直径2nm的DNA双螺旋链绕组蛋白形成直径11nm的核小体"串珠"结构.若以每碱基对沿螺旋中轴上升距离为0.34nm 计,200bpDNA(一个核小体的DNA片段)的伸展长度为68nm,形成核小体后仅为11nm(核小体直径),其长度压缩了6-7倍.在低离子强度和去H1组蛋白的条件下,电镜下可清晰地看到染色体一级包装的核小体纤维。
细胞核质分离提取的方法
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细胞核质分离提取的方法（大纲）一、引言1.1研究背景1.2细胞核质分离提取的意义二、细胞核质分离提取的基本原理2.1细胞结构概述2.2核质分离提取的基本过程三、细胞核质分离提取方法3.1物理方法3.2化学方法3.3生物方法四、细胞核质分离提取实验步骤4.1细胞样品的制备4.2核质分离4.3核质提取4.4核质纯化4.5核质质量检测五、细胞核质分离提取方法比较与选择5.1不同方法的优缺点5.2方法选择依据六、细胞核质分离提取在科研中的应用6.1基因组学研究6.2蛋白质组学研究6.3细胞信号传导研究七、实验注意事项及常见问题7.1实验操作注意事项7.2常见问题及解决方法八、总结与展望8.1细胞核质分离提取技术进展8.2未来发展方向与应用前景一、引言1.1研究背景细胞核质分离提取技术是细胞生物学与分子生物学领域中的一项基础性技术，广泛应用于基因表达调控、基因功能研究、基因调控网络构建等方面。
随着科学技术的不断发展，对细胞核质分离提取技术的要求也越来越高，需要更加精确、高效的方法来满足科研工作的需求。
细胞核质分离提取技术的研究与发展，有助于我们深入理解基因表达调控机制，为疾病的诊断、治疗和预防提供新的思路和方法。
DNA提取的操作
DNA提取的操作基因组dna提取基因组DNA提取试剂盒简介dna是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验，获得高分子量和高纯度的基因组dna 是非常重要的前提，因此基因组dna的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。
一、基因组dna提取的原则1.确保核酸一级结构的完整性（因为所有的遗传信息都存储在核酸一级结构中，完整的一级结构是保证核酸结构和功能研究的基本水平）。
2、排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺利进行。
二、基因组DNA提取的原理和方法dna与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。
染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。
从组织中提取dna必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与dna结合的组蛋白及非组蛋白。
1、样品预处理高纯度基因组DNA是从各种来源（如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等）的样本中提取的。
由于细胞结构和成分不同，样品的预处理方法也不同。
下面简要介绍常用萃取材料的预处理方法。
详情请参考本公司基因组DNA提取试剂盒说明书。
部分样品通过液氮研磨植物材料、动物材料均质、液氮研磨培养细胞、蛋白酶K处理和细菌溶菌酶破壁进行预处理酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液红细胞裂解液去红细胞2、细胞裂解ctab法：适合植物组织、真菌等。
ctab是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中(>0.7mnacl)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
sds法：适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。
sds是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体解析。
其他开裂方法：物理方式：机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解等酶法：蛋白酶k3、dna分离纯化纯化要求：核酸样本不应含有抑制酶的成分（如核酸内切酶、DNA聚合酶等）。
实验设计-细胞核的提取与鉴定
医学细胞生物学设计型实验设计报告姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的细胞核。
因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。
在本实验中我们采用排除法来制备核体。
排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。
细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。
因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。
【实验步骤】：1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。
2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。
3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。
4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。
5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。
6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。
7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。
用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。
8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。
【注意事项】：1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。
磁小体提取
磁小体提取磁小体是一种新型的细胞分离方法，也称磁珠分离技术。
该技术可通过磁珠对细胞的特异性识别和选择作用，实现对特定细胞亚群的选择和提取，具有高选择性、高稳定性、高灵敏性和高精度等优点，被广泛应用于生命科学、医学和生物制药等领域。
磁小体提取技术基于磁珠的磁性特性，利用磁感应现象在恒定的磁场中操作细胞或分子，实现对目标物质的分离和提纯。
该技术的基本原理是将磁性微珠与特定抗体或配体结合，形成带有特定生物学分子的磁性核壳结构。
这些核壳结构可以通过特定抗体或配体与目标细胞或分子结合，将其特异性地捕获在磁珠表面。
通过对磁性微珠的磁性控制，可以实现对目标细胞或分子的选择性分离和提取，并且不影响细胞或分子的生理学特性和生物活性。
磁小体提取技术的具体操作步骤包括：1. 制备磁性微珠。
磁性微珠可以通过化学合成、生物合成或自然来源等方式获得。
常用材料包括硅酸盐、铁氧体等。
2. 将磁性微珠与特定抗体或配体结合。
该步骤需要对磁性微珠进行表面修饰，以增加其与特定抗体或配体的结合能力和特异性。
通常使用的表面修饰剂包括硅烷或者活性甲醛化剂。
抗体或配体的结合可以通过共价键或非共价键实现。
3. 对细胞或分子进行预处理。
该步骤主要是为了改变细胞或分子的表面特性，以便与磁性微珠表面的特定抗体或配体结合。
通常使用的预处理方法包括去除胶原层、酶解等。
4. 加入磁性微珠，并进行特异性结合。
将包含磁性微珠的悬液加入到待分离细胞或分子的悬液中，并通过搅拌或轻微震荡等操作，使其充分接触，然后在外部施加恒定的磁场，促使磁性微珠特异性地结合到目标细胞或分子表面。
5. 分离和去除非特异性物质。
将含有细胞或分子的悬液通过磁场，将非特异性物质分离和去除。
6. 解除磁场和分离磁性微珠。
撤销外部磁场后，细胞或分子和磁性微珠即可分离。
可以通过离心、滤膜、整体分离等方法实现。
总之，磁小体提取技术是目前分离和提取细胞或分子的最先进方法之一，已被广泛应用于基础研究、临床医学、生物技术和生物制药等领域，特别是在细胞治疗、干细胞研究、肿瘤治疗、蛋白质纯化和基因工程等方面具有广阔的应用前景。
核小体及其提取技术
核小体及其提取技术核小体的形状类似一个扁平的碟子或一个圆柱体。
染色质就是由一连串的核小体所组成。
当一连串核小体呈螺旋状排列构成纤丝状时，DNA的压缩包装比约为40。
纤丝本身再进一步压缩后，成为常染色质的状态时，DNA的压缩包装比约为1000。
有丝分裂时染色质进一步压缩为染色体，压缩包装比高达8400，即只有伸展状态时长度的万分之一。
核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白(histone）构成，是染色质（染色体）的基本结构单位。
由几种组蛋白：每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。
这时染色质的压缩包装比(packing ratio）为6左右，即DNA由伸展状态压缩了近6倍。
200 bpDNA为平均长度；不同组织、不同类型的细胞，以及同一细胞里染色体的不同区段中，盘绕在组蛋白八聚体核心外面的DNA长度是不同的。
如真菌的可以短到只有154 bp，而海胆精子的可以长达260bp，但一般的变动范围在180bp到200bp之间。
在这 200bp中，146 bp 是直接盘绕在组蛋白八聚体核心外面，这些DNA不易被核酸酶消化，其余的DNA 是用于连接下一个核小体。
连接相邻2个核小体的DNA分子上结合了另一种组蛋白H1。
组蛋白H1包含了一组密切相关的蛋白质，其数量相当于核心组蛋白的一半，所以很容易从染色质中抽提出来。
所有的H1被除去后也不会影响到核小体的结构，这表明H1是位于蛋白质核心之外的。
核小体是细胞染色质中的一种成分，它是由DNA和组蛋白以特殊的方式相连而组成的。
在系统性红斑狼疮的诱导和致病中有重要作用。
每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1；组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构；146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈,组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。
核小体
人们接着用化学交联、高盐分离组蛋白，以及X衍射等方法进一步研究组蛋白多聚体的结构、排列以及怎样和DNA结合的，从而建立了核小体模型。1984年Klug和Butler进行了修正。核小体的构造可用图表示：
核小体
每一个核小体结合的DNA总量为200bp左右，一般在150~250变化范围（micrococcal nuclease)轻微消解染色质而得知的。连接两个核小体的连接DNA(linker DNA)是最容易受到这种酶的作用，因此微球菌核酸酶在连接DNA处被切断，此时每个重复单位的DNA长约200bp，而且是和五种组蛋白相结合，保持着核小体的结构。也就是“绳珠”结构的绳被切断，剩下一个一个的“珠”。
电泳的结果和电镜观察到“绳珠”结构之间是什么样的关系呢？Kornberg和Thomas 1974年用实验回答了这一问题。他们先用小球菌核酸酶稍稍消化一下染色质，切断一部分200核苷酸对单位之间的DNA，使其中含有单体、二聚体、三聚体和四聚体等。然后经离心将它们分开。每一组再通过凝胶电泳证明其分子大小及纯度。然后分别用电镜来观察各组的材料；结果单体均为一个100Å的小体，二聚体则是两个相联的小体，同样三聚体和四聚体分别由三个小体和四个小体组成，表明200核苷酸的电泳片段长度级差正好是电镜观察到的一个：“绳珠”单位，他们称其为核小体（nucleosome）或核粒，提出了染色质结构的“绳珠”模型。
所属学科：
生物化学与分子生物学（一级学科）；酸与基因（二级学科）
定义2：
组成真核细胞染色体的基本结构单位，由组蛋白和大约200个bp的DNA组成的直径约10 nm的球形小体。其核心由H2A、H2B、H3和H4四种组蛋白各两个分子组成八聚体构成。
所属学科：
细胞生物学（一级学科）；细胞结构与细胞外基质（二级学科）
细胞的核小体与副核小体
超分辨显微镜
突破光学显微镜的分辨率 极限，能够观察到核小体 和副核小体的超微结构。
分子生物学方法检测表达水平
RT-PCR
通过逆转录和聚合酶链式 反应检测特定基因的 mRNA表达水平。
免疫荧光染色
利用特异性抗体对核小体 和副核小体进行染色，观 察其在细胞内的定位和表 达情况。
Western Blot
成核小体的核心部分。
核小体之间通过连接DNA相连，形成串珠状的染色质纤维。
03
在染色体中定位和功能
01
核小体在染色体中呈线性排列，是构成染色体的基 本单位。
02
核小体通过其特殊的结构和组成，在染色体复制、 转录和修复等过程中发挥重要作用。
03
核小体的定位和排列方式对于维持染色体的稳定性 和完整性具有重要意义。
调控机制
这些酶类通过催化特定的化学反应，如组蛋白乙酰化、去乙酰化、磷酸化等，调控核小体和副核小体的组装和去 组装过程。
组装过程中能量消耗问题
能量来源
ATP水解提供能量，驱动染色质重塑和核小体组装过程。
能量消耗
核小体和副核小体的组装需要消耗大量的能量，这是细胞代谢的重要部分。
异常组装导致疾病发生
异常组装类型
相互转化。
03
核小体与副核小体组装过程
组装起始信号和分子机制
组装起始信号
DNA复制或转录过程中产生的特定信号 ，如组蛋白修饰、DNA甲基化等。
VS
分子机制
通过特定的蛋白质-蛋白质、蛋白质DNA相互作用，形成有序的核小体和副 核小体结构。
关键酶类及其调控机制
关键酶类
如组蛋白乙酰转移酶、组蛋白去乙酰化酶、ATP依赖的染色质重塑复合物等。
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核小体及其提取技术
核小体的形状类似一个扁平的碟子或一个圆柱体。
染色质就是由一连串的核小体所组成。
当一连串核小体呈螺旋状排列构成纤丝状时，DNA的压缩包装比约为40。
纤丝本身再进一步压缩后，成为常染色质的状态时，DNA的压缩包装比约为1000。
有丝分裂时染色质进一步压缩为染色体，压缩包装比高达8400，即只有伸展状态时长度的万分之一。
核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白(histone）构成，是染色质（染色体）的基本结构单位。
由几种组蛋白：每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。
这时染色质的压缩包装比(packing ratio）为6左右，即DNA由伸展状态压缩了近6倍。
200 bpDNA为平均长度；不同组织、不同类型的细胞，以及同一细胞里染色体的不同区段中，盘绕在组蛋白八聚体核心外面的DNA长度是不同的。
如真菌的可以短到只有154 bp，而海胆精子的可以长达260bp，但一般的变动范围在180bp到200bp之间。
在这 200bp中，146 bp 是直接盘绕在组蛋白八聚体核心外面，这些DNA不易被核酸酶消化，其余的DNA 是用于连接下一个核小体。
连接相邻2个核小体的DNA分子上结合了另一种组蛋白H1。
组蛋白H1包含了一组密切相关的蛋白质，其数量相当于核心组蛋白的一半，所以很容易从染色质中抽提出来。
所有的H1被除去后也不会影响到核小体的结构，这表明H1是位于蛋白质核心之外的。
核小体是细胞染色质中的一种成分，它是由DNA和组蛋白以特殊的方式相连而组成的。
在系统性红斑狼疮的诱导和致病中有重要作用。
每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1；组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构；146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈,组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。
包括组蛋白H1和166bp DNA的核小体结构又称染色质小体；两个相邻核小体之间以连接DNA相连，典型长度60bp，不同物种变化值为0～80bp；组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列，实验表明，核小体具有自组装 (self-assemble) 的性质；核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响
基因表达。
其功能与染色质的浓缩有关，且能够进行自装配。
在80%的MRL/lprDIL小鼠中可产生核小体特异性抗体，该自身抗体产生早，先于其他抗核抗体，与肾小球肾炎有关。
SLE患者多克隆核小体特异性自身抗体的抗原反应与鼠类SLE模型表现相似，核小体在SLE中作为主要自身抗原已得到证实。
靶器官中免疫复合物的沉积和炎性介质（包括补体）的大量活化是引起SLE全身性组织炎症损伤的基本机制之一。
核小体会成为多克隆B细胞活化剂，这可能与SLE疾病的起始阶段有关；但更重要的是，核小体是SLE中致病性T 辅助细胞识别的自身抗原，不仅引起同源B细胞产生核小体特异性自身抗体，而且引起抗DNA抗体和抗组蛋白抗体的形成。
AnuA在抗ds?DNA阴性的SLE患者中有很高的阳性率（可达60%~65%)[8，16]，因此AnuA对SLE患者更具有诊断价值。
已经有证据表明，除了传统的致病性抗双链DNA抗体及其抗原抗体复合物外，核小体和组蛋白成分的自身抗体及其抗原抗体复合物，在SLE的发病机制中起关键作用，尤其是在DIL肾炎致病机制上意义重大[6]。
核小体的组蛋白成分（氨基末端带强阳性电荷）可促进免疫复合物与肾小球基底膜阴离子位点的结合，包括既作为植入抗原使原位免疫复合物得以形成，也可使含有核小体特异性抗体的循环免疫复合物得以沉积。
在以上两种情况下，均可使肾小球基底膜的通透性增加，且产生炎性免疫应答反应。
钟清等[7]研究表明，LN组患者AnuA阳性率明显高于无肾炎组，AnuA对LN的诊断和监测具有重要意义。
此外，苏茵等[8]也发现AnuA与患者的皮疹、脱发、ESR增快、CRP增高、补体降低呈显著相关性，其滴度高低也与SLE疾病活动指数评分呈明显正相关。
核小体提取方法：
1、称取5g小牛胸腺*浸于150ml 0.9% NACL粉碎，得到均一悬浮液。
过滤除去粗糙物。
2、悬浮液1100g，4℃离心15min。
沉淀用30ml 0.9% NACL重悬离心两次。
3、沉淀用40ml蔗糖I溶液（250mM蔗糖，3mM CACL2.2H2O）重悬，5000g，4℃离心
12min。
4、沉淀用45ml蔗糖II溶液（2M蔗糖，3mM CaCl2.2H2O，0.5% Triton-Tx-100）重悬，13200g，
4℃离心22min。
5、沉淀用45ml BufferI (0.1M Tris/HCL,pH8.0) 重悬, 1100g，4℃离心15min.
6、沉淀重悬于45ml 0.9% NACL溶液，1100g，4℃离心15min。
7、沉淀重悬于40ml BufferII（15mM Tris/HCL,pH7.5, 0.15mM Nacl, 60mM KNO3,0.25M蔗
糖，5mM Cacl2.2H2O,1mM DTT），混匀，加入750UNITS核酸酶S7，37℃水浴温育30min。
4000rpm，4℃,离心15min。
8、沉淀重悬于10ml 2mM EDTA，室温振荡温育45min。
4000rpm，4℃,离心15min。
9、弃上清，沉淀即为传统工艺提取的核小体。
*可为其他动物组织，如鼠肝脏、兔胸腺、或动物细胞如鸡红血球和细胞培养液等。