大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的
转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
• 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转
化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
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常用的感受态细胞制备方法
KCl法， CaCl2法，电击感受态制备等 • RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，
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分 子实 生验
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提高转化效率的几个因素
• 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从 －70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备 感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生 长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 DH5α 菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
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学
提高转化效率的几个因素
• 细胞生长状态和密度 • 质粒的质量和浓度 • 试剂的质量 • 防止杂菌和杂DNA的污染
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转化过程
转化
• 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异
株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,它可以容忍
外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的1.了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点;2.质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法.二、实验原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增，而大肠杆菌转化实验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊方法（如点击法，CaCl2处理）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。
CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温，低渗（0℃0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基--钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短暂热冲击处理，促使DNA复合物进入细胞，从而实现外源基因的转化。
三、实验材料（一）样品1.连接了目的基因的重组体分子2.细菌——大肠杆菌DH5α菌株：R （限制酶缺陷型），M（甲基化修饰缺陷型），Amp。
（二）试剂1.LB固体和液体培养基（营养培养基）和含Amp的LB固体培养基（选择培养基）；2.氯化钙溶液（1）0.01mol/Lcacl2溶液：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml水中，定容至100ml，高压灭菌后备用。
（2）保存液（含15%甘油的0.01mol/Lcacl2）：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml 水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌后备用。
3.氨苄青霉素（Amp）母液配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
（三）仪器及器材①超净工作台；②恒温摇床；③离心机；④V-1100分光光度计；⑤水浴锅；⑥微量移液器。
四、实验步骤（一）操作步骤1.感受态细胞的制备和保存感受态细胞的制备试验步骤步骤操作（1）细菌小量培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃180r/min震荡培养过夜（2）扩大培养取细菌悬液1ml，以1:100的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃震荡培养1-2h至A600=0.5左右（3）收集菌体将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后4℃5000r/min离心10min，弃上清（4）cacl2处理菌体加入1/10体积（10ml）0-4℃预冷的无菌cacl2（0.01mol/L）溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置10min后，4℃5000r/min离心10min，弃上清（5）感受态细胞的手机与分装加入2000ul预冷的无菌cacl2e(0.01mol/L)重新悬浮细胞，分装成100ul备用（6）长期保存加入1600ul预冷的无菌cacl2(0.01mol/L)和400ul无菌的70%甘油轻轻悬浮细胞或直接加保存液200ml，冰上放置几分钟后，分装成100ul小份，液氮速冻10min后，-70℃保存备用2.转化DNA转化实验步骤步骤操作（1）冰浴取100ul感受态细胞悬液，在冰浴中加入10ul连接产物（或质粒DNA）（含量不超过50mg，体积不超过10ul），轻轻混匀，冰上静置30min（2）热击转化产物在42℃水浴中热击90s（勿摇动，勿超时），之后迅速置于冰上冷却2min（3）复苏向管中加入1mlLB液体培养基，37℃，100-180r/min震荡培养45min至菌液肉眼观察到轻微浑浊（4）涂板，培养取上述菌液100ul涂板，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h（二）注意事项1.细胞的生长状态和密度。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态制备及转化
大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。
由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。
本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。
感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。
为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。
常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。
培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。
感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。
首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。
培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。
其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。
最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。
感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。
转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。
转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。
常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。
质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。
将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。
转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。
电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。
化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。
转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备生工1201班122303121 小斌一、实验目的掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法二、实验原理遗传物质的传递，一般常用接合转移、细胞融合、转导、转染、转化等方法进行。
转化是指某一细胞由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型与表型的改变。
感受态是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为在细菌生长对数期的后期是发展感受态的理想时期。
三、实验材料水浴锅、制冰机、离心机、超净工作台、恒温培养箱、各式移液器、培养皿；大肠杆菌DH5α；LB液体培养基、0.1M CaCl2溶液。
四、实验步骤①挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃，250r/min，过夜。
②取150μl过夜培养物接种于15ml LB液体培养基中， 37 ℃，250r/min，培养至OD600 ≈0.375（一般为2h左右，呈云雾状，使细菌处于对数早期或中期）。
③将培养物1.5ml分装到预冷无菌的指形管中，冰上放置5～10min。
4 ℃，2000rpm，10min，弃上清。
④沉淀用1ml冰冷的CaCl2溶液重悬， 4 ℃，2000rpm，10min。
⑤重复步骤④。
⑥用200μl冰冷的CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min，备用。
五、思考题重组基因的导入方式有哪些？答：1.重组基因导入细菌的方式：（1）转化：主要包括热激法或热休克转化法、电转化法。
（2）转导：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
2.重组基因导入真核细胞的方式：（1）酵母细胞：原生质体转化、Li+盐转化；（2）植物细胞：农杆菌介导法、电击法、基因枪法；（3）哺乳动物细胞：磷酸钙沉淀法、脂质体载体法、显微注射法、 DEAE---葡聚糖转染法。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第3页
试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
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在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载
体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。
转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受态细胞到达饱和。
一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与pBS 质粒共保温,实现转化。
由于pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp 的培养基上不能生长。
能在Amp 培养基上生长的受体细胞〔转化子〕肯定已导入了pBS。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS 质粒共保温,实现转化。
由于pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp 的培养基上不能生长。
能在Amp 培养基上生长的受体细胞〔转化子〕肯定已导入了pBS。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
2. 材料、设备及试剂
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS 质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。
易生物试剂库
二. 设备
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
易生物仪器库
三. 试剂
1.LB 固体和液体培养基：配方见第一章。
2.Amp 母液：配方略。
3.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入A mp 储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g 麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp 储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
mol/L CaCl2溶液:称取CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入
15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。
3.操作步骤
一、受体菌的培养
从LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50 的比例接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3 小时至OD600 ＝0.5 左右。
二、感受态细胞的制备( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10 分钟,然后于4℃下3000g2溶液10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30 分钟后,4℃下3000g2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl 的小份,贮存于-70℃可保存半年。
三、转化
1、从-70℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、加入pBS 质粒DNA 溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30 分钟后。
3、42℃水浴中热击90 秒或37℃水浴5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。
4、向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24 小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
四、计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率〔转化子数／每mg 质粒DNA〕＝转化子总数／质粒DNA 加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。
但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
DNA实验技术交流论坛：。