白血病细胞免疫表型流式细胞分型技术及意义(FlowCytometer)

FACSVantage Fluid System
激发光源与光束 成形系统
激光（Laser,
Light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光 源。单谱线，高强度. 细 胞在1-2us内就可以收集 到足够强的荧光信号.一 般采用Ar+激光器,有多 条可调谱线,与多种荧光 染料激发谱匹配.
90 Degree Light Scatter (SSC)
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
细胞散色光信号
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
荧光信号
激光束
Injector Tip
Sheath fluid
通过流动室后细 胞一个一个排列 成单行,依次通过 检测区.把流动室
称为单细胞流 发生器.
流动室
Flow Cell
孔径50-200m 检测区离喷口200m 有分选功能
Laser
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。
液滴冲电:脉冲幅度,荷电多少,宽 度大小同时带电液滴数多少.
- Charged Plates
静电高压偏转板: 几千伏电压 分选细胞的收集装置: 96孔板,载玻片或试管
FSC Sensor Fluorescence detector
+
Single cells sorted into test tubes
1979年 国家科委重点项目： 研制国内第一台激光流式细胞仪
1982年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生 1984年国家科委组织科研成果的鉴定验收
1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖 1985年--1990年 灵敏度、信噪比、更多参数
流式分选仪研制开发 计算机四参数软件 样品制备、医学生物学应用
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
信号转换系统:光 电 数字信号.
FCM细胞分选装置
超声振荡器:20-40KC
液流断离点:离喷口5-8mm
f=v/4.5d
488 nm laser
什么是流式细胞术(FCM)？
FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项 能快速、精确的对单个细胞理化特性进行
多参数定量分析和分选的技术。
Laser
FALS Sensor
特点:
流动的 可以是活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞
FCM的一般结构和原理
速度 轨迹 检测
散射光 荧光
流动室
2-3mm方形石英 内径直200-300m 流速慢,细胞信号大, 小型化。
BD公司不同型号流式细胞仪
FACSCalibur
FACSCanto
FACSCount
LSRII
FACSAria
FACSVantage&DiVa
Coulter公司不同型号流式细胞仪
EPICS XL/XLMCL
台式机
CytomicsTM FC 500 系列
最新型
EPICS Altra细胞分选仪 大型科研型
利用单克隆抗体分离细胞亚群
MACS-Magnetic Cell Sorting
磁
阳
阴
珠 分 离
性 选 择
性 选 择
细胞分选系统
通道式分选
电荷式分选
细胞信号检测与分析处理系统
细胞散色光的波长是与激发光波长一致的.
前向散色光信号:光电二极管
侧向及荧光信号用光电倍增管
Flow cell
Dichroic Filters
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
PM4 T
PMT
3
光电管
Laser
PMT可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号,电 脉冲信号通过模数转换器(ADC)量化为数字信号.
细胞散色光信号
Forward Angle Light Scatter (FSC)
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
白血病细胞免疫表型流 式细胞分型技术及意义
（FlowCytometer）
SSMU
Shi Gui Ying
分析细胞学
细胞的形态学Leabharlann Baidu数 定量 细胞化学成分及含量
生物学特征
细胞的功能
Laser
FALS Sensor
分析细胞学 年青的交叉学科
激光技术 数字计算机技术 电子物理技术 电子摄像技术 光电测量技术 荧光细胞化学技术 单克隆抗体技术等
DNA Histogram（完善） 1969 Hulett:Sorter(Icp-22) 1973 B-D:First commercial FCM--FACS I（发展） 1979 SSMU: FCM Developing（推广） 1980 BJNU: First FCM (FACS III) in China About 450 FCMs in China
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞荧光 经过各种特异染色的细胞在激
发光的照射下可测到较强的荧光信号.
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
特 异 染 色 的 荧 光 信 号
细胞荧光信号
荧光信号的测量：
经过PMT将光学信号转变为电脉冲信号，并增加PMT 的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种 ：
FCM History
1934 Moldavanl first try（从固定式细胞分析-流动式） 1953 Crosland-Taylor:laminar flow（解决难题） 1956 Coulter（初次应用 ） 1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho（开 1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,
球透镜和柱面透镜 ：
光 束
20×200m 椭圆形光，短轴和细胞流平行，长 轴与细胞流垂直。
成
形
与
细
胞
受
照
方
式
光
束
这种椭圆形光斑的
成
检测区保证每个细
形
胞分别受到光照
与
且受检时受到一致
细 胞 受
激发光焦斑
的光照 FCM的 单细胞照明技术.
照
方
式
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
光收集系统：滤光片