8蔗糖酶Km值测定
蔗糖酶米氏常数的测定预习报告
蔗糖酶米氏常数的测定预习报告一、实验目的1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响。
2.学习测定米氏常数的原理和方法。
二、实验原理在酶的研究应用中，人们经常会遇到底物浓度对酶反应速度的影响的问题。
Michaelis 和Menten 得到了一个表示底物浓度与反应速度之间相互关系的方程式，称为米氏方程式。
][][S Km ＋S νυ=式中v 为最大反应速度，Km 为米氏常数。
由上式可见，米氏常数是当酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
其单位是浓度单位，一般用mol/L 或mmol/L 表示。
米氏常数是酶的特征性物理常数。
一种酶，在一定的实验条件(25℃，最适pH)下，对某一种底物，有一定的Km 值。
不同的酶有不同的Km 值。
因此，测定酶的Km 值可以作为鉴别酶的一种手段。
米氏常数的求法很多，但是，最常用的是LineweaVer —Burk 的作图法(双倒数作图法)。
将米氏方程式改写为下列倒数形式：实验时，选择不同的[S]，测定相应的v ，求出两者的倒数，以1/[S]为横坐标，以1/[v]为纵坐标作图，绘出一条直线(图84-1)，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km 。
此法由于方便而应用最广，但亦有缺点，实验点过分集中于直线的左端，因而作图不易十分准确。
图84-1 酶促反应速度倒数与底物浓度倒数的关系曲线三、实验用品1.器具：722分光光度计、恒温水浴试管、吸量管、秒表、坐标纸、血糖管。
2.药品：⑴0.1mol/L蔗糖溶液⑵0.2mol/L NaAc缓冲溶液(pH4.6)⑶lmol/LNaOH溶液，2mol/LNaOH溶液⑷3,5-二硝基水杨酸试剂：称取10g 3,5-二硝基水杨酸溶于200ml mol／L NaOH中，加入300g酒石酸钾钠·4H2O，再用去离子水稀释至2000ml。
3.材料：自制蔗糖酶溶液。
四、实验方法1.取试管12支，按1～12编号，1号为空白。
2.按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入12支试管中，于35℃水浴中保温10min。
《生物化学》实验-评分标准
《生物化学》实验评分标准（供参考）一、基本操作（供实验操作考核参考）：1、玻璃仪器的洗涤①用毛刷蘸去污粉、肥皂粉或去污剂将器皿内外两面彻底刷洗干净（30分）②用自来水将仪器冲洗干净。
洗干净的玻璃仪器应该表面光洁，淋洗的水成片的从仪器上流下来，不应该有水珠（水线）附着在内壁。
（40分）③用少量的蒸馏水淋洗内壁三次（20分）④将洗干净的器皿倒置放在干净的滤纸上或相应的器皿架上（10分）2、刻度吸管①左手控制吸耳球，右手控制吸管，用右手食指控制吸管上口，右手拇指和中指夹持管身。
（30分，左手优势者酌情考虑）②操作者眼睛与要观察的刻度线应该处于同一水平，应该观察液面凹陷处的最低点与刻度线平齐。
（30分）③吸管下方如有液滴附着应该处理掉（20分）④操作是否规范和熟练、善后工作是否做好（20分）3、移液器①更换并安装好移液器头，右手控制移液器，调节移液器上方的罗盘到需要的刻度。
（30分）②按移液器上方活塞到遇到明显阻挡的位置时停止，插入试剂中慢慢吸取溶液。
不应该有气泡或断层出现。
（30分）③移液器头如有液滴附着应该处理掉。
（10分）④将移液器上方活塞按到最低点，排尽移液器头内所有液体（20分）⑤善后工作（10分）4、离心机①将调节转数旋钮归零，时间旋钮应该自然归零。
（10分）②将离心管放入离心套管中，置于天平上加水配平后，对称放入离心机内。
（30分）③接通电源，调节时间选钮（应该比规定时间多1-2分钟，20分）④慢慢调节转数选钮到规定转数停止（20分，依照不同的离心机规格要求可略有不同）⑤善后工作（20分）5、分光光度计①接通电源→预热30分钟（教师预先做好，必要时询问下即可）②调节波长→将空白液、测定液倒入比色杯（液面距杯口约1cm）→擦镜纸擦干净比色杯→置于比色槽中（30分，注意放置的方向及拿比色杯的姿势）③空白管对准光路→开盖调节透光度“0”，闭盖调节透光度“100%”→反复校对一次→关闭盖子情况下将模式调节到“吸光度”→空白管吸光度应该为“0”→拉动拉杆→依次读出各测定管吸光度→每打开盖都要重新调节“0”和“100%”。
分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
实验报告解析（目的要求、基本原理、仪器试剂和实验步骤四个部分可参阅实验预习或者实验内容部分，数据处理部分参见数据处理）一、实验重点1、掌握本实验的基本原理。
2、掌握实验中用到仪器的操作方法，并能熟练使用。
3、了解实验中的注意事项并能解释为什么。
二、实验难点1、葡萄糖标准曲线的绘制2、反应实验条件的控制三、注意事项1、分光光度计使用注意事项：(1)使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和原理，以及各个旋钮之功能。
(2)仪器接地要良好，否则显示数字不稳定。
(3)如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。
(4)仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥，发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用。
(5)当仪器停止工作时，关掉电源，电源开关需同时切断，并罩好仪器2、葡萄糖标准曲线的绘制要精确3、反应条件要严格安要求控制四、思考题回答1、为什么说米氏常数是一个特征性常数，而且最大反应速度不是？米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。
米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。
Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。
它的意义如下：它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。
它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。
它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。
限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。
km测定实验报告
km测定实验报告KM测定实验报告引言：KM测定是一种常用的酶动力学实验方法，用于测定酶的催化活性。
本实验旨在通过对酶催化反应速率的测定，探索KM值对酶活性的影响，并深入理解酶催化过程的基本原理。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 酶溶液：选择一种适合的酶作为实验对象，如过氧化氢酶。
- 底物溶液：选择一种合适的底物，如过氧化氢。
- 缓冲液：根据实验需要选择适当的缓冲液，如磷酸盐缓冲液。
- 辅助试剂：如辅酶、金属离子等。
- 试剂盒：包括所需的试管、移液管、离心管等。
2. 实验方法：- 步骤一：制备酶溶液。
按照实验要求，将酶粉末溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的酶溶液。
- 步骤二：制备底物溶液。
按照实验要求，将底物溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的底物溶液。
- 步骤三：实验组设置。
根据实验要求，设置不同浓度的底物溶液，配制不同的实验组。
- 步骤四：开始实验。
将实验组中的底物溶液分别加入试管中，并在恒温条件下加入相应浓度的酶溶液，开始反应。
- 步骤五：反应停止。
根据实验要求，选择适当方法停止反应，如加入某种试剂或调整pH值。
- 步骤六：测定反应产物。
使用合适的测定方法，如分光光度法或比色法，测定反应产物的浓度。
- 步骤七：数据处理。
根据实验结果，计算不同实验组的反应速率，并绘制相关曲线。
实验结果与讨论：通过实验，我们得到了不同浓度底物溶液在酶催化下的反应速率数据，并绘制了相关的酶动力学曲线。
根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. KM值的影响：- KM值是酶底物结合的亲和力指标，表示酶与底物结合的紧密程度。
KM值越小，表示酶与底物结合越紧密，酶对底物的亲和力越高。
- 实验结果显示，随着底物浓度的增加，反应速率逐渐增加，但增速逐渐减缓。
当底物浓度接近KM值时，反应速率趋于饱和，增速几乎为零。
- 这表明KM值对酶催化速率有重要影响，较小的KM值意味着酶对底物的亲和力更高，反应速率更快。
2. 酶活性与酶浓度的关系：- 实验结果还显示，随着酶浓度的增加，反应速率也随之增加。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
从米氏常数_Km_的测定谈药学生物化学实验教学
在生物化学学生实验及酶学实验中, 酶的特征 常数 米氏 常数 Km 的 测定 是必 须做 的一 个试验。 但是该实验对实验者在操作中的要求较高。通过几 年的教学实验, 笔者发现学生往往很难得到理想的 结果。不是因为学生的能力差 , 而是实验本身在设 计上有值得改进之处。 一、 实验中存在的问题 生物化学实验教学中 , 多年来药学院校一直采 用的教材是 生物化学实验与指导 ( 中国医药科技 出版社, 韦平和主编 ) 。米氏常数的实验是测定酵母 中蔗糖酶的 Km, 通常将它作为考试实验, 学生在做 实验时更紧张, 更容易出现问题, 常常不能取得预期 的结果。 该实验原理为: 蔗糖酶水解蔗糖生成葡萄糖, 葡 萄糖与二硝基水杨酸反应生成有颜色的物质, 经比 色分析, 测定生成的还原性葡萄糖的含量, 以确定酶 的反应活力。 在该实验教材中 , 显色是以 3 ml 的二硝基水杨 酸与葡萄糖进行反应 , 溶液稀释至 25 ml, 然后进行 显色沉淀以确定蔗糖 水解的反应初速 度。以 5 ml 0 1mol/ L NaOH 终止酶反应。然而使用 这种方法 , 大部分学生难以在初次做酶学 实验获得理想 的结 果。 二、 教学中改进 基于酶学实验的特性和学生实验的特点, 在教 学中首先做了如下改进: 1 将 3 ml 二硝基水杨酸改为 1 ml 进行反应。 因为加入 3 ml 二硝基水杨酸后反应总体积为 5 ml, 已经适合做比色测定 , 并且不浪费。
参考文献 [ 1] 韦平和 . 生物 化学实 验与 指导 [ M] . 北京 : 中国 医药 出 版社 , 2003, 51 59. [ 2] 张龙翔 , 张庭 芳 , 李令媛 生化实 验方 法和 技术 ( 第 二 版 ) [ M] . 北京 : 高等教育出版社 , 1997, 143 151. [ 3] 李 艳利 , 冯东举 医学院校研 究室分子生 物学初探 [ J] . 微生物通报 , 2004, 31: 137 139. [ 4] 王镜岩 , 朱圣 庚 , 徐长 法 生 物 化学 ( 第三 版 ) [ M ] . 北 京 : 高等教育出版社 , 2002, 351 383. [ 5] Reithel J Ureases The Enzymes, Vol IV, Boyer P D, ed, 3rd, NewYork, London; Academic Press, 1971: 1 21
分光光度法测蔗糖酶米氏常数_数据处理方法
For i = 2 To n c4 ( i ) = ( a2( i ) - b1) / mL ∋葡萄糖的浓度 V ( i ) = c4( i ) / t ∋蔗糖的反应速度
Nex t i c = 0 ( d = 0 ( Sxx = 0 ( Syy = 0 ( Sxy = 0 ∋最小二乘法直线拟合 For i = 2 T o n c = c + X( i ) (d = d + Y( i ) Nex t i ax = c / ( n- 1) (ay = d / ( n- 1) For i = 2 T o n xt = X( i ) - ax ( yt = Y ( i ) - ay Sx x = Sx x + xt * xt ( Sy y= Sy y+
For m1. H ide
∋隐藏窗体 For m1
co( 1) = Val( T ex t 7. T ex t ) ∋将对象 T ex t7
的 T ex t 属性转换为数值赋给数组元素 co ( 1)
yt* yt ( Sxy= Sxy+ xt* yt
Nex t i
K2 = Sxy / Sx x ( b2 = ay - K 2 * ax ( r2 =
的学说, 导出了著名的米氏方程, 即
V = V max & Cs / ( Km+ Cs) .
( 1)
式中 V 为反应速率, Cs 为底物浓度, Km 为米氏
常数.
米氏常数是反应速率达到最大值的一半时的
底物浓度, 即当 V = 1/ 2V max 时, Km = Cs, 基于
这一点, 测定不同浓度时的酶反应速率,
1 实验原理
酶是由生物体内产生的具有催化活性的一类 蛋白质, 表现出特异的催化功能. 酶的催化效率
实验八蔗糖水解反应速率常数的测定
物理化学实验报告序号：学生姓名：学号：学院：化学化工学院班级： 10级制药班专业：制药工程指导老师：张建策实验名称：蔗糖水解反应速率常数的测定实验日期： 2012年5月9日实验室： 7408同组者：实验八 蔗糖水解反应速率常数的测定一、实验目的1. 根据物质的光学性质研究蔗糖水解反应，测定其反应速率常数。
2. 了解旋光仪器仪的基本原理,掌握其使用方法。
二、实验原理蔗糖在水中转化成葡萄糖与果糖，其反应为：C 12H 22O 11 + H 2O −→−+H C 6H 12O 6 + C 6H 12O 6(蔗糖) (葡萄糖) (果糖)它属于二级反应，在纯水中此反应的速率极慢，通常需要在H +离子催化作用下进行。
由于反应时水大量存在，尽管有部分水分子参与反应，仍可近似地认为整个反应过程中水的浓度是恒定的，而且H +是催化剂,其浓度也保持不变。
因此在一定浓度下，反应速度只与蔗糖的浓度有关，蔗糖转化反应可看作为一级反应。
一级反应的速率方程可由下式表示：dc-=c tk d式中：c 为蔗糖溶液浓度，k 为蔗糖在该条件下的水解反应速率常数。
令蔗糖开始水解反应时浓度为c 0，水解到某时刻时的蔗糖浓度为c t ，对上式进行积分得：ln=tc kt c该反应的半衰期与k 的关系为：122=lnt k蔗糖及其转化产物，都具有旋光性，而且它们的旋光能力不同，故可以利用体系在反应进程中旋光度的变化来度量反应进程。
测量物质旋光度所用的仪器称为旋光仪。
溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力，溶剂性质，溶液浓度，样品管长度及温度等均有关系。
当温度、波长、溶剂一定时，旋光度的数值为：[]t D L C αα= 或 K C α=式中L 为液层厚度，即盛装溶液的旋光管的长度；C 为旋光物质的体积摩尔浓度；[α]D t 为比旋光度；t 为温度；D 为所用光源的波长。
在其他条件不变的情况下，旋光度α与反应物浓度C 呈正比。
即'K C α=比例常数'K 与物质旋光能力，溶剂性质，样品管长度，光源的波长，溶液温度等有关。
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底物浓度与酶促反应速度
管号 试剂
1
2
3
4
5
6
7
0.3 M蔗糖溶液ml
0.04 0.06 0.08 0.10 0.20 0.40
0.60
H2O
1.66 1.64 1.62 1.60 1.50 1.30
1.10
pH5.0醋酸缓冲液，ml
0.2
0.2
实验八 蔗糖酶Km值测定
原理 底物浓度对酶活性的影响
1. 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。
2. Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所 对应的底物浓度。
3. 不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值 也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。
0
0.1
（1:20; 1:50; 1:100; 1:200）
沸水浴煮5min
取出后经自来水冷却3 min，加入9 ml蒸馏水，以对照管调零点，
于520nm处测光密度值。 要求测得的A520nm值在标准曲线范围内靠近最大值。
为什么？
葡萄糖标准曲线的制备
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
1mg/ml标准葡萄糖溶液 0 ml
一、蔗糖酶的溶解
• 酶粉溶于1 ml蒸馏水，10000 rpm室温离心 5分钟后去掉不溶物，此时即为酶原液。
二、蔗糖酶稀释以及活力测定
1、将酶原液按照一定比例稀释，建议1:10，1:20， 1:50和1:100。不同稀释倍数的酶液各准备2 ml。
2、稀释后酶液的活力测定。
为什么要将酶液进行稀释？ 为什么选择合适酶活力的酶液进行Km测定？
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.1mol/L醋酸缓冲液
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2pHΒιβλιοθήκη .0mlH2O ml
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
二硝基水杨酸溶液ml
2
2
2
2
2
2
加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（100℃）中准确煮5 min，取出 用自来水冷却3min，加入9 ml蒸馏水，混匀后以零号管调零，于 520nm处测定光密度。
思考题
• Km值的含义及测定的方法。
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
25℃预热3分钟
加入0.1ml稀释合适倍数的酶液
25℃准确反应5 min，迅速加入2 ml二硝基水杨酸溶液 混匀，沸水浴5min，自来水冷却3min，加入9ml蒸馏水，以对照管调“0”，520nm测OD值。
每只试管均要做自身对照
结果处理
管号 结果
12
3
4
5
OD520
葡萄糖产量，mg
4. 测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本 内容之一。
原理 米氏方程和双倒数作图法
酶反应速度与底物浓度之间的定量关系
[S]表示底物浓度 Vmax表示最大酶促反应速度
Lineeraver-Burk（林-贝氏作图法）
实验步骤
一、蔗糖酶溶解 二、蔗糖酶稀释以及活力测定 三、底物对反应速度的影响（Km测定）
3、葡萄糖标准曲线的制备。
酶活力预试
1
2（对照）
0.3M蔗糖溶液ml
0.60
0.60
H2O
1.1
1.1
pH5.0醋酸缓冲液ml
0.2
0.2
25℃水浴中保温3min
稀释后的蔗糖酶溶液ml
0.1
0
（1:20; 1:50; 1:100; 1:200;
）
25℃水浴5min
二硝基水杨酸试剂
2
2
稀释后的蔗糖酶溶液ml
v =[葡萄糖产量•10]
1ml酶在单位时间(5min)内的葡萄 糖产量 (mg)
[S]=0.3V/2
(mol/L)
1/[S]
1/v
6
7
v代表生成产物葡萄糖的速率（5min单位时间内1ml酶液反应生成的葡萄糖的量）； [S]=0.3V/2 ： [S]代表底物蔗糖的摩尔浓度；V代表每只试管中加入的底物蔗糖的 体积（ml）；2指的是反应的总体积是2ml；0.3为底物蔗糖的浓度。