碱性磷酸酶Km值的
AKP Km值测定
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
8 0.00
0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
VMAX
1/2VMAX
1/Vmax
1/[s]
[S] Km
-1/Km
底物浓度与反应速度关系曲线
双倒数曲线
【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产生 的原因 比较两种Km测定方法各自的优缺点
0.90 1.00
蒸馏水
混匀后37℃水浴，预温5分钟左右
酶液
0.1 0.1
0.1
0.1
0.1
0.1 0.1
0.1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴）， 反应开始。
从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应，各管反应时间应准确一 致，为15分钟。
碱性溶液
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
Vmax•[S] + 1/ Vmax
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
1.了解酶的Km值测定原理和方法
2.掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测
绘制双倒数曲线
一、实验内容 二、实验报告要求
实验目的
1、掌握底物浓度对酶促反应速度的 影响
2、掌握米曼氏方程、Km值的意义及 双倒数作图求Km的方法。
一、实验内容
（一）实验原理 （二）实验操作
（一）实验原理
（磷酸苯二钠法 ）
O AKP
P ONa + H2O
O OH + HO P
管号
A510值
1
23
4567
8
空白 调零
【注意事项】
1、底物、血清取量务必准确。 2、 保温时间务必准确。 3、绘制双倒数曲线时，一定要过
原点
（二）721分光光度计的使用 （三）常规仪器的使用
2、数据结果计算
底物浓度(mmol／L) 3
4
5
6
8
12
16
0
1／[S]
1／v
（1／A510）
0.33 0.25 0.20 0.16 0.12 0.08 0.06
0.5mol／L NaOH（碱液）
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1.0
4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10min左右，以8号管空白调零，于510nm比色，记录 各管的吸光度。
①直线形状 ；②计算Km值
二、实验报告要求
（一）实验名称 （二）实验原理 （三）实验操作表、OD值纪录 （四）结果处理：作图
1、绘制矩形双曲线坐标图 2、绘制双倒数曲线坐标图、并求出Km值
ONa
碱性磷酸酶Km值的 ppt课件
碱性磷酸酶Km值的
4
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km值的
8
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
碱性磷酸酶Km值的
9
7
注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
1
2
3
4
5
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
9:00:00 9:00:30 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00
9:01:30 9:16:30
9:02:00 9:17:00
6
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9:02:30 9:03:00
碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
碱性磷酸酶Km值的
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
碱性磷酸酶Km值的
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
碱性磷酸酶米氏常数的测定实验报告
碱性磷酸酶米氏常数的测定实验报告实验目的：1、学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理。
2、测定牡蛎碱性磷酸酶水解对硝基苯磷酸钠盐时的Km和Vm值u。
实验原理：1、米氏方程：V=Vm[S]/Km+[S]其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数.Vm/2=Vm[S]/Km+[S]Km=[S]Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是浓度单位。
米氏常数K是酶的一个基本特征常数。
2、动力学参数的测定:测定Km和Vm，可通过作图法求得。
最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法米氏方程转化为倒数形式，即：1/v=Km/Vm*1/[S]+1/Vm3、本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm反应式：产物对硝基苯酚pNP在405nm波长有吸收可通过分光光度法测定产物pNP的含量测定并制作产物pNP的标准曲线根据催化反应产生的产物OD值从标准曲线求出产物浓度，换算成反应速度v。
实验试剂与器材：试剂：0.5μmol/mL pNP 溶液、10 mmol/L pNPP溶液、20 mmol/L MgCl2,溶液、0.1 mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、碱性磷酸酶。
器材：恒温水浴锅、722分光光度计实验操作流程：1.对硝基苯酚标准曲线的制作取15支试管编号，0号一支，1-7号各二支，按下表操作：以对硝基苯酚的绝对量(μmol数）为横坐标，OD405nnm值为纵坐标，绘制标准曲线。
求出PNP的摩尔消光系数(s）值。
2.反应速度测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照分别以01-05调零点，测定对应样品管ODq0s。
3.数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。
从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm。
相当于产物对硝基苯酚的μmol数。
碱性磷酸酶Km值的ppt课件
精选课件
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加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
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9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
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实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
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注意事项
• 1 做如下表格
1234 5 6 7 Abs [S] 1/ABS 1/[S]
• 2 可电脑作图
• 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16)
• 4 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终 必须得出结论：Km值等于多少
碱性磷酸酶Km值的测定
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1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
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2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
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3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
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V Vmax Vmax/2
Km
❖ Km
Vmax ＝ Vmax[S]
碱性磷酸酶Km值的测定
4-氨基安 替比林
铁氰化钾
1.0 1.0 2.0 2.0
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管
为空白，于5l0nm比色，记录各管的光密 度
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【实验结果】
1、原始数据
结果记录 1 2 3 4
5
OD
底物浓度 1 3 5 6 8 mmol/L
精品课件
Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度，
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
碱性磷酸酶km实验报告
碱性磷酸酶km实验报告目录1. 引言1.1 背景1.2 研究目的1.3 重要性2. 实验方法2.1 材料和仪器2.2 实验步骤3. 实验结果3.1 数据收集3.2 数据分析4. 讨论4.1 结果解释4.2 可能影响因素5. 结论6. 参考文献7. 致谢1. 引言1.1 背景在生物化学领域中，碱性磷酸酶是一种重要的酶类，它在生物体内起着关键的调节和催化作用。
研究碱性磷酸酶的特性和功能对于深入了解生物体内的代谢过程具有重要意义。
1.2 研究目的本实验旨在通过测定碱性磷酸酶的KM值，探究其在底物浓度与酶速率之间的关系，从而更好地理解碱性磷酸酶的催化机制。
1.3 重要性了解碱性磷酸酶的KM值有助于预测酶与底物之间的键合情况，进而指导药物设计和生物工程领域的研究。
2. 实验方法2.1 材料和仪器本实验所需材料包括碱性磷酸酶标准品、底物显色底物液、缓冲液等。
实验所用仪器包括分光光度计、移液器等。
2.2 实验步骤1. 准备不同浓度的碱性磷酸酶标准品溶液。
2. 配制不同浓度的底物显色底物液。
3. 在反应孔中加入不同浓度的碱性磷酸酶标准品溶液和底物显色底物液，混匀反应。
4. 在一定时间间隔内测定吸光度，并绘制曲线。
3. 实验结果3.1 数据收集根据实验步骤所得到的吸光度数据，通过计算可得到碱性磷酸酶的KM 值。
3.2 数据分析通过实验数据的分析，我们可以得出不同底物浓度下酶的活性以及KM值等关键参数。
4. 讨论4.1 结果解释根据实验结果，我们可以推断碱性磷酸酶与底物之间的亲合力大小，以及酶在不同底物浓度下的活性表现。
4.2 可能影响因素在讨论部分，还可以探讨实验结果可能受到的影响因素，并提出进一步的研究方向。
5. 结论通过本实验，我们成功测定了碱性磷酸酶的KM值，并对其在底物浓度与酶速率之间的关系有了更深入的认识。
6. 参考文献列出本实验中所涉及的相关文献，供读者深入了解碱性磷酸酶的研究现状。
7. 致谢感谢所有参与本实验的同事和支持者，以及提供实验材料和设备的单位。
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Vmax ：最大反应速度 (maximum velocity) Ｋm：米氏常数 (Michaelis constant)
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度 。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的 亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的 Km值。
V Vmax Vmax /2
Km
? Km
Vmax ＝ Vmax[S]
2
Km + [S]
[S]
Km＝[S]
Ｋm值与Ｖmax 值的测定
双倒数作图法
V=
Vmax [S] K m +[S] 两边同取倒数
1/V=
Km
1/[S]
Vmax
+ 1/Vmax
（林－贝氏方程）
注意事项
? 1 底物和酶取样准确 ? 2 保温时间准确
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
1
9:00:00 9:15:00
2
9:00:30 9:15:30
3
9:01:00 9:16:00
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9:01:30 9:16:30
5
9:02:00 9:17:00
6
7
9:02:30 9:03:00
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km 值的测定
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
பைடு நூலகம்
对反应速率的影响呈
矩形双曲线 关系。 [S]
Ｖ＝ ─KVmm─+ax[S[S] ]
[S]：底物浓度
[S] V：不同 时的反应初速度
实验报告
? 1 绘制矩形双曲线图
? 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km 值
注意事项
? 1 做如下表格
1234 5 6 7 Abs
[S]
1/ABS
1/[S]
? 2 可电脑作图 ? 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数 (1/2,1/16) ? 4 实验的最终目的是测得Km 值，因此实验报告最终