酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定
碱性磷酸酶km值的测定实验报告
碱性磷酸酶km值的测定实验报告篇一:碱性磷酸酶Km值得测定(1)碱性磷酸酶Km值得测定原理在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【S】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。
关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。
将米氏方程变形为双倒数方程对1/S作图可算出Km步骤，以1/V结果由y=+算出当y=0时x=，继而算出Km值=L讨论计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。
1实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。
尿蛋白定性检测原理加热可以使蛋白质变性，溶液pH等于pI时溶解度最小。
步骤1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。
2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。
3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。
结果未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显讨论正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。
尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。
分子筛层析(凝胶过滤法)原理多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。
大分子先出，小分子后出。
步骤1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。
2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入2混匀的待层析液。
3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。
4.在上口加洗脱液洗脱。
每支小试管接1cm液体，并编号。
5.观察不同小试管的液体颜色的变化。
结果讨论分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。
篇二:碱性磷酸酶的Km测定篇三:酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)本科学生实验报告学号 0姓名孙永升学院实验课程名称酶工程 < 实验 >教师及职称开课学期至学年填报时间年月日云南师范大学教务处编印13234km操作流程:A稀释:原酶液底物B预热 : 各预热10minC取液 :稀释到10000倍的纤维素酶液不同浓度的底物溶液D反应50 水浴中保温30minF 测定3mLDNS反应终止沸水浴5min 定容至25ml 测定OD540吸光值G 作双倒数图求Km实验注意事项本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
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五、实验结果与分析
1、标曲数据
管号
1
2
3
4
5
6
酚含量（μg）
吸光度（A）
2、绘制标准曲线
3、反应数据
管号
1
2
3
4
5
6
基质浓度[S] 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00
1/[S]
酚含量
V
1/V
4、作 1/V
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=
Km/
Vmax·（1/[S]）+1/
Vmax
直线，求Km值
数据处理： 各管测出吸光度值A，以酚标准曲线 查出各管释放酚含量（μg），根据 公式V= —酚—含—量 即可计算出各管反 应速度V15min
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TANKS
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[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
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实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。 酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物， 颜色深浅和酚的含量成正比。 根据吸光度可以从酚标准曲线上查知酚含量，从而计算化学反应速度。
Km值：数值上等于酶促反应速度为最大反应 速度一半时所对应的底物浓度
即当V=Vmax/2时，Km=[S]
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Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
碱性磷酸酶米氏常数的测定实验报告
碱性磷酸酶米氏常数的测定实验报告实验目的：1、学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理。
2、测定牡蛎碱性磷酸酶水解对硝基苯磷酸钠盐时的Km和Vm值u。
实验原理：1、米氏方程：V=Vm[S]/Km+[S]其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数.Vm/2=Vm[S]/Km+[S]Km=[S]Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是浓度单位。
米氏常数K是酶的一个基本特征常数。
2、动力学参数的测定:测定Km和Vm，可通过作图法求得。
最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法米氏方程转化为倒数形式，即：1/v=Km/Vm*1/[S]+1/Vm3、本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm反应式：产物对硝基苯酚pNP在405nm波长有吸收可通过分光光度法测定产物pNP的含量测定并制作产物pNP的标准曲线根据催化反应产生的产物OD值从标准曲线求出产物浓度，换算成反应速度v。
实验试剂与器材：试剂：0.5μmol/mL pNP 溶液、10 mmol/L pNPP溶液、20 mmol/L MgCl2,溶液、0.1 mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、碱性磷酸酶。
器材：恒温水浴锅、722分光光度计实验操作流程：1.对硝基苯酚标准曲线的制作取15支试管编号，0号一支，1-7号各二支，按下表操作：以对硝基苯酚的绝对量(μmol数）为横坐标，OD405nnm值为纵坐标，绘制标准曲线。
求出PNP的摩尔消光系数(s）值。
2.反应速度测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照分别以01-05调零点，测定对应样品管ODq0s。
3.数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。
从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm。
相当于产物对硝基苯酚的μmol数。
碱性磷酸酶km值测定 实验报告
碱性磷酸酶km值测定实验报告碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）是一种重要的酶类物质，在生物体内发挥着关键的生物学功能。
为了更好地了解碱性磷酸酶的性质和功能，我们进行了碱性磷酸酶的KM值测定实验。
实验中，我们首先准备了一系列不同底物浓度的反应液，并添加了一定浓度的碱性磷酸酶。
然后，通过测定一定时间内底物浓度的变化，我们可以得到不同底物浓度下反应速率的数据。
在实验中，我们选择了两种常用的底物——对硝基苯磷酸钠（p-NPP）和酚酞磷酸钠（BTP）来进行测定。
p-NPP是一种无色底物，在碱性条件下可以被碱性磷酸酶催化水解生成对硝基苯酚，其产物可以通过测定吸光度来确定反应速率。
而BTP是一种红色底物，在碱性条件下可以被碱性磷酸酶催化水解生成酚酞，其产物可以通过测定吸光度来确定反应速率。
通过实验数据的处理和分析，我们得到了不同底物浓度下的反应速率和底物浓度的关系。
通过拟合实验数据，我们可以得到反应速率与底物浓度之间的动力学关系。
根据麦克斯韦-玛尔蒙方程，我们可以得到碱性磷酸酶的KM值。
KM值是一个重要的酶学参数，它反映了底物与酶结合的亲和力。
KM值越小，表示底物与酶结合的亲和力越强，底物浓度较低时就能够达到较高的反应速率。
而KM值越大，表示底物与酶结合的亲和力较弱，需要较高的底物浓度才能达到较高的反应速率。
通过实验测定，我们可以得到碱性磷酸酶的KM值，进而了解其底物结合特性。
这对于研究碱性磷酸酶的功能和调控机制具有重要意义。
同时，通过比较不同底物的KM值，我们还可以了解底物对于碱性磷酸酶的亲和力差异，进一步揭示酶底物特异性的原理。
除了测定KM值，我们还可以通过其他实验方法来研究碱性磷酸酶的功能和特性。
例如，可以通过测定酶的最适温度和最适pH值来了解酶的适应范围。
此外，还可以通过测定酶的抑制剂对酶活性的影响来研究酶的抑制机制。
这些实验方法的综合应用可以更全面地了解碱性磷酸酶的生物学功能。
综上所述，碱性磷酸酶KM值的测定是研究酶特性和功能的重要手段之一。
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
V
Vmax [S] Vmax
以不同的底物浓度—1—为横坐标，
[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
蒸馏水/mL
1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20
37℃水浴5min
血清/mL
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
最终基质浓度（[S]）
2.00 4.00 6.00
8.00 16.00 0.00
37℃Байду номын сангаас温15min
碱性溶液/mL
1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
0.5％ 铁氰化钾、0.3％ 4-氨基安替比林、酚标准液（0.1mg/mL） • 器材：恒温水浴锅、可见光分光光度计、移液枪
四、实验步骤
一． 酚标准曲线的绘制
(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
管号
1
2
3
4
5
6
0.1mg/mL 酚标准溶液/mL
0.0
0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水/mL
2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴5min
碱性溶液/mL
1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10
0.3% 4-氨基安替比林/mL
1.0
1.0
碱性磷酸酶米氏常数的测定
碱性磷酸酶米氏常数的测定[目的与要求]通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。
学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。
[原理]在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。
酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。
酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。
若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。
当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。
V = V max[S]/(K m+[S])上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。
当V= V max/2时，K m =[S]。
所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。
因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。
K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。
酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。
林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。
图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。
碱性磷酸酶km值测定
Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度 成正比。
意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的
转换数(turnover number)，即动力学常数K3。
酶的转换数
定义 — 当酶被底物充分饱和时，单位时间 内每个酶分子催化底物转变为产物的 分子数。
意义 — 可用来比较每单位酶的催化能力。
酶促反应模式——中间产物学说
E+S
k1 ES k3 E + P
k2
中间产物
※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底
物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程 式( Michaelis equation)。
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
[S]：底物浓度 V： 不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
实验数据及结果
管号 1 2 3 4 5 6
A650
1/A650
[s]
1/ [s]
以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值。
【注意事项】
⑴加入碱性磷酸酶液的量要准确，否则误差较大。 ⑵保湿时间要准确。
【实验讨论】
Km值的定义和意义是什么？ 米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？
米－曼氏方程式推导基于两个假设：
(1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分 解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V＝k3[ES]。
(2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始
阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
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可逆性抑 制作用
抑制剂通常以共 价键与酶活性中 心或活性中心以 外的必需基团相 结合，使酶失活 。
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞争 竞争性 性
非竞争 非竞 性
Km增大
争性
Vmax降低
反竞争 反竞 性
争性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
pH 对反应速度的影响
在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性 通常称 酶具有最大的催化活性,通常称 在一定的 此pH 为最适 pH。 。
激活剂对反应速度的影响
酶的激活剂
必需激活剂， 必需激活剂， 大多为金属离 ＋ 子，Mg2＋，K＋ ＋ ，Mn2＋，等
非必需激 活剂
抑制剂对反应速度的影响
不可逆性 抑制作用
酶促反应动力学 实验
影响酶促反应速度的因素
酶浓度 B 底物 浓度 A 酶促反 应速度 F 抑制剂 E C D pH值 pH值 温度
激活剂
酶浓度对反应速度的影响
底物浓度 >酶浓度 >酶浓度
酶被底物 饱和
正比例 关系
温度对反应速度的影响
一方面是温度升高, 一方面是温度升高 酶促反应速度加快。 酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高 温度升高, 另一方面 温度升高 酶的高级结构将发 生变化或变性， 生变化或变性，导 致酶活性降低甚至 丧失。 丧失。 在最适温度条件下, 在最适温度条件下 反应速度最大。 反应速度最大。
Lineweaver-Burk Plots of Inhibited Enzymes
实验原理
磷酸苯二钠 碱性磷酸酶
H2O pH=10.0， 37℃
酚 OH－
Na2HPO4
酚试剂 磷钼钨酸） （磷钼钨酸）
650nm 蓝色化合物 吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
米氏常数的求法
1
V
× [S] + = V max
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km
1
1
Vmax
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km 值的测定
米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的 常数，通过实验， 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。 的方法。 的方法
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7 A650 1/A650 [S] 1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作 图，求出碱性磷酸酶的Km
在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合， 在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合， 即不能形成EIS，I竞争结合酶活性中心，其动力学特征 竞争结合酶活性中心， 即不能形成 ， 竞争结合酶活性中心 米氏常数的表观值Km增加 酶的最大反应速度Vm 增加， 是：米氏常数的表观值 增加，酶的最大反应速度 不变。。 不变。。 在非竞争性抑制中，抑制剂、 在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形 结合酶活性中心以外部位， 成EIS， I结合酶活性中心以外部位，不影响 与S之间 ， 结合酶活性中心以外部位 不影响E与 之间 的结合，但是EIS不能进一步转变为产物 不能进一步转变为产物， 的结合，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特 征是： 降低而 不变。 降低而Km不变 征是：Vm降低而 不变。 在反竞争性抑制中， 在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后 才能和酶结合形成EIS，其动力学特征是；Km和Vm都降 才能和酶结合形成 ，其动力学特征是； 和 都降 低。 上述三种抑制类型， 上述三种抑制类型，可在抑制剂存在下通过动力学特征 图形判断
当反应速度等于最大速度 一半时,即 一半时 即V = 1/2 Vmax, Km = [S] 上式表示,米氏常数是反应 上式表示 米氏常数是反应 速度为最大值的一半时的底 物浓度。 物浓度。 因此,米氏常数的单位为 因此 米氏常数的单位为 mol/L。 。
即为米氏常数， Km 即为米氏常数，
Vmax为最大反应速度
低 高
反应速度和底物浓 度
反应速度增 底物度 的增高 酶 底物 和
研究前提
单底物、单产物反应 酶促反应速率一般在规定反应条 件下，用单位时间内底物的消耗 量或产物的生成量来表示。 反应速率取其初速率，即底物的消 耗量很小(≤5%)时的反应速率。 底物浓度远远大于酶浓度。
矩形双曲线
米－曼氏方程式
操作
试剂(ml) 2.5mM磷酸苯二钠 蒸馏水 碱性缓冲液 碱性磷酸酶液 酚试剂 碱性磷酸酶液 10％ Na2CO3
取8支试管，按下表加入试剂。
1
0.2 0.8 1.0
2
0.3 0.7 1.0
3
0.4 0.6 1.0
4
0.5 0.5 1.0
5
0.6 0.4 1.0
6
0.8 0.2 1.0
7
1.0 1.0
8
1.0 1.0
混匀后，370C水浴 5 min
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -
混匀后，370C水浴 15 min（准确计时）
1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 1.0 0.1 3.0
混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点， 在650nm波长处进行比色，读取各管A值。
米氏常数Km的意义
不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重 要的特征物理常数。 要的特征物理常数。 值只是在固定的底物， Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不 条件下，一定的缓冲体系中测定的， 条件下 同条件下具有不同的Km值。
Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值 值表示酶与底物之间的亲和程度： 大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km 大表示亲和程度小，酶的催化活性低
值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 值小表示亲和程度大 酶的催化活性高。 酶的催化活性高
Vmax
定义： 是酶完全被底物饱和时的反应速度， 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度， 与酶浓度成正比。 与酶浓度成正比。 意义： 意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的 转换数(turnover number)，即动力学常数K3。 转换数 ，即动力学常数