碱性磷酸酶Km值的 ppt课件
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碱性磷酸酶Km值的测定
精品课件
Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度，
当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
精品课件
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v－1／[s]作图，将各点连线，在横轴 截距为-／km，据此可算出Km值。
1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
精品课件
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O 酚
AKP OH-
苯
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
精品课件
【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产 生的原因
比较两种Km测定方法各自的优缺点
精品课件
6
78
12
16
0
1/[S] 1/OD
1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -
精品课件
2、作图
以 [s]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km 值
以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴 作图，观察曲线形状；查Km 值
比较两个值的差异.
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碱性磷酸酶Km值的 测定
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Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度，
当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
精品课件
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v－1／[s]作图，将各点连线，在横轴 截距为-／km，据此可算出Km值。
1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
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本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O 酚
AKP OH-
苯
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
精品课件
【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产 生的原因
比较两种Km测定方法各自的优缺点
精品课件
6
78
12
16
0
1/[S] 1/OD
1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -
精品课件
2、作图
以 [s]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km 值
以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴 作图，观察曲线形状；查Km 值
比较两个值的差异.
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碱性磷酸酶Km值的 测定
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碱性磷酸酶km值的测定
酶液
0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴） ，
混匀 ， 室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白 ， 于5l0nm比色 ， 记录各管的光密度
碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1 2 30.05 0. 150.90 0.900.95 0.85
管号底物液 (0 .04M)碳酸缓液 (pH= 10)蒸馏水
混匀后37℃水浴 ， 预温5分钟左右
【
】
反应开始。从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应 ， 各管反应时间应准确一 致 ， 为15分钟。
■ 比较两个值的大小,分析实验误差产生 的原因
底物浓度 mmol/L
1/ [S]
1/OD
【
】
4 5
1 2
8
6
3
3
5
7
1
1
/ OD510为纵轴作 图 ， 观察曲线形状； 查Km值■
s]为横轴，
■ 以
1
1
1/ [s- 1/Km
底物浓度与反应速度关系曲线
双倒数曲线
1/2VMAX
VMAX
[S]
的原因■ 比较两种Km测定方法各自的优缺点
/ km ， 据此可算出Km
1/ Vmax
距3;4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 (红色醌衍生物
:
:磷酸苯二钠+H2O
（红色
AKP
)
4 5 6 7 80.25 0.30 0.40 0.60 0.800.90 0.90 0.90 0.90 0.900.75 0.70 0.60 0.40 0.20
4-氨基安 替比林铁氰化钾
0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴） ，
混匀 ， 室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白 ， 于5l0nm比色 ， 记录各管的光密度
碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1 2 30.05 0. 150.90 0.900.95 0.85
管号底物液 (0 .04M)碳酸缓液 (pH= 10)蒸馏水
混匀后37℃水浴 ， 预温5分钟左右
【
】
反应开始。从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应 ， 各管反应时间应准确一 致 ， 为15分钟。
■ 比较两个值的大小,分析实验误差产生 的原因
底物浓度 mmol/L
1/ [S]
1/OD
【
】
4 5
1 2
8
6
3
3
5
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1
1
/ OD510为纵轴作 图 ， 观察曲线形状； 查Km值■
s]为横轴，
■ 以
1
1
1/ [s- 1/Km
底物浓度与反应速度关系曲线
双倒数曲线
1/2VMAX
VMAX
[S]
的原因■ 比较两种Km测定方法各自的优缺点
/ km ， 据此可算出Km
1/ Vmax
距3;4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 (红色醌衍生物
:
:磷酸苯二钠+H2O
（红色
AKP
)
4 5 6 7 80.25 0.30 0.40 0.60 0.800.90 0.90 0.90 0.90 0.900.75 0.70 0.60 0.40 0.20
4-氨基安 替比林铁氰化钾
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1
2
3
4
5
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
9:00:00 9:00:30 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00
9:01:30 9:16:30
9:02:00 9:17:00
6
7
9:02:30 9:03:00
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
精选课件
8
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
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9
注意事项
• 1 做如下表格
1234 5 6 7 Abs [S] 1/ABS 1/[S]
• 2 可电脑作图
• 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16)
• 4 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终 必须得出结论：Km值等于多少
碱性磷酸酶Km值的测定
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1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
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2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
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3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
精选课件
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V Vmax Vmax/2
Km
❖ Km
Vmax ＝ Vmax[S]
碱性磷酸酶Km值的测定
1.0
1.0
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
4-氨基安 替比林
1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0
2.0Leabharlann 2.02.02.0 2.0
2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录 OD 1 2 3 4 5 6 7 8
底物浓度 mmol/L
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 8 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90 0.95 0.85
0.90 0.90 0.75 0.70
0.90 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
Vmax•[S] + 1/ Vmax
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
Vmax•[S]
V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。
碱性磷酸酶的活力测定 ppt课件
（2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
PPT课件
12
•问题2：
• 如何测定酶活性？
PPT课件
8
诊断常用血清酶
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDH
山梨醇脱氢酶
SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶 AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS PPT课件
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
9
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
PPT课件
1
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有什 么意义？
PPT课件
2
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
PPT课件
12
•问题2：
• 如何测定酶活性？
PPT课件
8
诊断常用血清酶
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDH
山梨醇脱氢酶
SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶 AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS PPT课件
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
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碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
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1
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有什 么意义？
PPT课件
2
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定26页PPT
可逆性抑 制作用
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞竞争争性 性
Km增大
非非争性竞竞性争
Vmax降低
反反竞竞争 争性 性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
低
反应速度和底物浓 度成正比关系
反应速度增幅下降
高
底物浓度
的增高
酶活性中心被底物饱和
米氏常数的求法
1
V
=
Km Vmax
×
1 [S]
+
1
Vmax
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km个相当重要的 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。
实验原理
磷酸苯二钠
H2O
碱性磷酸酶
酚 Na2HPO4
pH=10.0，
37℃ OH－（磷酚钼试钨剂酸）
650nm 蓝色化合物
吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点，
在650nm波长处进行比色，读取各管A值。
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7
A650
1/A650 [S]
1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作
碱性磷酸酶Km值的测定..
本实验旨在测定碱性磷酸酶的Km值，以了解酶的特性和底物亲和力。实验原理基于米氏方程，通过在不同底物浓ห้องสมุดไป่ตู้下测定酶促反应速度，进而利用双倒数方程求解Km值。实验中使用了磷酸苯二钠作为底物，通过其与碱性磷酸酶反应生成的酚类物质，再与4-氨基安替比林反应形成红色醌衍生物，从而根据颜色深浅测定酶活性。实验准备了包括底物液、碳酸盐缓冲液、碱性磷酸酶溶液等试剂，并严格按照操作步骤进行。在反应过程中，保持恒定的温度、pH值和酶浓度，以确保实验结果的准确性。通过记录不同底物浓度下的光密度值，并绘制双倒数曲线，最终求解出碱性磷酸酶的Km值。实验结果不仅反映了酶与底物的亲和力，也为进一步研究酶的动力学特性提供了重要数据。
碱性磷酸酶Km值测定
V Vmax
[S]
Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时 V
Vmax
Vmax/2 Km [S]
Vmax 2
Vmax[S] ＝ Km + [S] Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(LineweaverBurk)作图法
Байду номын сангаас 三、操作方法
参见实验讲义
四、思考题
1.测定Km值还有哪些方法？ 2.测定Km值有何实际意义？
V= Vmax[S]
Km+[S]
两边同取倒数
Km 1/V= + 1/Vmax 1/[S] Vmax （林－贝氏方程）
本实验以碱性磷酸酶为样品： 碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷 酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作 用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物， 根据红色的深浅可测出酶活力的高低，测 定不同浓度底物时的酶活性。
碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物根据红色的深浅可测出酶活力的高低测定不同浓度底物时的酶活性
碱性磷酸酶Km值测定
一、实验目的
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.了解米孟方程、Km值的物理意义及双 倒数作图求Km的方法。
二、实验原理
[S]
Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时 V
Vmax
Vmax/2 Km [S]
Vmax 2
Vmax[S] ＝ Km + [S] Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(LineweaverBurk)作图法
Байду номын сангаас 三、操作方法
参见实验讲义
四、思考题
1.测定Km值还有哪些方法？ 2.测定Km值有何实际意义？
V= Vmax[S]
Km+[S]
两边同取倒数
Km 1/V= + 1/Vmax 1/[S] Vmax （林－贝氏方程）
本实验以碱性磷酸酶为样品： 碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷 酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作 用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物， 根据红色的深浅可测出酶活力的高低，测 定不同浓度底物时的酶活性。
碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物根据红色的深浅可测出酶活力的高低测定不同浓度底物时的酶活性
碱性磷酸酶Km值测定
一、实验目的
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.了解米孟方程、Km值的物理意义及双 倒数作图求Km的方法。
二、实验原理
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[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
碱性磷酸酶Km值的
4
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km值的
8
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
碱性磷酸酶Km值的
9
7
注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
1
2
3
4
5
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
9:00:00 9:00:30 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00
9:01:30 9:16:30
9:02:00 9:17:00
6
7
9:02:30 9:03:00
碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
碱性磷酸酶Km值的
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
碱性磷酸酶Km值的
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
碱性磷酸酶Km值的
5
V Vmax Vmax/2
Km
❖ Km
Vmax ＝ Vm]
[S]
Km＝[S]
碱性磷酸酶Km值的
6
Ｋm值与Ｖmax值的测定
双倒数作图法
Vmax[S] V = Km+[S]
两边同取倒数
1/V=
Km Vmax
1/[S] + 1/Vmax
（林－贝氏方程）
碱性磷酸酶Km值的
碱性磷酸酶Km值的
4
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km值的
8
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
碱性磷酸酶Km值的
9
7
注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
1
2
3
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加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
9:00:00 9:00:30 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00
9:01:30 9:16:30
9:02:00 9:17:00
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9:02:30 9:03:00
碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
碱性磷酸酶Km值的
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
碱性磷酸酶Km值的
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
碱性磷酸酶Km值的
5
V Vmax Vmax/2
Km
❖ Km
Vmax ＝ Vm]
[S]
Km＝[S]
碱性磷酸酶Km值的
6
Ｋm值与Ｖmax值的测定
双倒数作图法
Vmax[S] V = Km+[S]
两边同取倒数
1/V=
Km Vmax
1/[S] + 1/Vmax
（林－贝氏方程）
碱性磷酸酶Km值的