第1讲细胞因子与细胞粘附因子的测定(精)

(2) MTT 比色法
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
细胞增殖或抑制活性检测的MTT比色法常用靶细胞
细胞株/原代细胞 B9，MH60,BSF2,TTD1
BCL-1（M）增殖法
干扰因素 IL-2、IL-4 IL-4
IL-4
GN-CSF、IL-5 IL-6、EPO IL-2 IL-4
各类细胞因子检测的常用靶细胞-2
细胞因子 IL-6
IL-7 IL-8 GM-CSF
TNF/ IFN
实验系统
干扰因素
B9（M）增殖法
IL-4、IL-11
BM60（H）增殖法
B9-11 B9-1-3 KYM-1D4
MV-3D9 WEHI-164/clone13
32D/Mp110S
L929 CTLL-2 小鼠基质细胞, 32DCL-27
细胞终浓度（细胞数/ml） 5×104/2×105 5×104 5×104
2×103
5×103 2×103
1×103
2×105 105
1.5×105
细胞病变抑制法结果判断举例*
标本稀释度 log4 3 4 5 6 7 8
两孔平均 CPE 0 0 0
1.5 2.5 0
细胞病变 抑制程度
4 4 4 2.5 1.5 0
细胞病变 抑制积累
16 12 8 4 1.5 0
细胞病变 积累
0 0 0 1.5 4 8
细胞病变 抑制率
16/16 (100%)
12/12 (100%)
血液循环
内分泌 endocrine
远距离作用
多效性 IL-4 pleiotropy
活化、
B
增殖、
分化
胸腺细胞
增殖
肥大细胞
增殖
重叠性
IL-2、
redundancy IL-4、
IL-5
均有刺激B细胞
B
增殖的功能
协同性 synergy
IL-4 + IL-5
拮抗性 antagonism
IL-4 IFN-
第一讲 细胞因子与细胞粘 附因子的测定
任春锋
第一节 生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价
第二节 免疫测定方法 一、ELISA方法 二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价
• 粘附因子功能及应用：主要功能是调节细胞与 细胞、细胞与间质之间的相互作用。病理情况 下，由于粘附因子在细胞表面或血循环中的数 量和质量有所改变，进而影响原有细胞与细胞、 细胞与间质之间的平衡，因此，细胞内外粘附 因子的测定对于某些疾病的发生发展机制探讨、 辅助诊断、治疗监控及预后方面有重要应用价 值。
加入MTT前温育时间（h） 96/48 96 96 72
120 72
44
56 22-24
72
检测细胞因子 IL-6 IL-11 IL-13
TGF-β TNF
TNF IL-2 IL-3
二、细胞毒活性测定法
基 本
对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因 此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死 细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增
细胞病变程度分为5个等 级，即：
“0”，表示无明显CPE； “1+”，CPE≤25％； “2+”，CPE为25～50％； “3+”，CPE为50～75％； “4+”，CPE为75～100％。 根据病变程度找出CPEI50的标 本稀释范围，并以此计算出距 离比例和确定IFN效价。
该法操作复杂、影响因素较 多，在试验前应对所用的病毒 进行滴定。
4-8
M-CSF/G-CSF
(2) MTT 比色法
原理：一种不使用放射性核素，以细胞代谢作为 细胞增殖指示物的细胞因子生物活性间接测定方法。
MTT在活细胞线粒体中的在脱氢酶的作用下，被还 原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，其量与细胞 增殖的程度呈正比。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积 在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。
细胞粘附因子
是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用 的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表 达和可溶性两种形式存在。
细胞因子的主要生物学作用
1、抗感染和抗肿瘤 2、免疫调节作用 3、刺激造血细胞增殖分化 4、参与和调节炎症反应 5、其它
细胞因子以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF- 趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）—— EGF、FGF、IGF、PDGF
B B细胞
B
更有效地诱导IgE 类别转换
IFN- 阻断IL-4诱 导类别转化的作用， IL-4抑制IFN-
细胞因子检测的方法
免疫学检测方子生物学检测方法——基因表达检测
粘附因子以结构特点进行划分的分类
1、粘蛋白样家族（integrin family） 2、免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IgSF) 3、选择素家族（selectin family） 4、整合素家族（Integrin family） 5、钙离子依赖性家族（简称钙粘素Cadherin） 6、其它未归类的粘附分子如CD36、CD44、CD45等
第一节 生物学测定方法
生物活性测定法原理
根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的靶细胞 指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中 细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示
有助于细胞因子 检测的活性作用
刺激细胞增殖或集落形成的活性 维持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效应 促进细胞趋化或抗病毒作用
第三节 分子生物学检测方法 一、Northern和Southern Blot 二、PCR和RT-PCR 三、原位杂交、原位PCR和原位RT-PCR
第四节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用 一、临床应用原则 二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后
细胞因子
是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌 的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫 应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。
UT-7
CCL-64* DA3.15, IF M14/NES60.4
所需浓度（细胞数/ml）
2×105 2×105
105 5×104
105 5×103 5×104 1×105
105 105 3×104 105
1.5×105
5×108 5×104 5×104
3H-TdR前培养时间
48 56 24 24 24 48 36 24 72 24 66 72
常用于攻击细胞的病毒 VSV、EMCV及Sindbis virus等
检测抗病毒活性的方法 抑制病毒的致细胞病变效应(CPE)、
抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量
本法常用于IFN测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细 胞不受病毒感染，抑制病毒产生细胞病变效应（CPE）。细胞因子样品处理易感细 胞，使细胞建立抗病毒状态，然后用适量病毒攻击细胞，评价病毒的复制量或病毒 引起细胞病变被抑制的程度，即可判断样品中细胞因子的生物活性。
胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标
准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。
本法常用于TNF等的测定
三、抗病毒活性测定法
常用于检测抗病毒活性的细胞株 Wish、Hep2/c 人干扰素
L929
小鼠干扰素
Ratec
大鼠干扰素
A549
MDBK 多种族的IFN-α和IFN-γ
Clone-IXN/2b（M）增殖法
中性粒细胞（M、H）趋化法
TF-1（H）增殖法
IL-3、IL-5
IL-6、IL-5
L929 （M、H）细胞毒法
wish（H）病变保护法
IFN- 、 IFN-
L929（M）病变保护法
IFN- 、 IFN-
五、生物学活性测定方法学评价
优点 • 生物学活性的测定 • 灵敏度高 缺点 • 特异性差 • 操作繁琐 • 易受干扰
3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法
代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标 记或可溶性分子测定法
(1) 放射性核素掺入法
原理：通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方 法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱 基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I ），通 过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。
结果客观易于自动化； 适用于大标本量的测定
方法的特异性受依赖细胞 株影响；放射性污染
常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件