分子生物学常用技术-基因操作
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
分子生物学常用技术(二)
分子生物学常用技术（二）引言概述:本文旨在介绍分子生物学中常用的技术，以帮助读者全面了解分子生物学研究的方法和工具。
本文将重点介绍分子生物学常用技术（二），包括基因克隆、PCR、DNA测序、基因编辑和蛋白质表达等。
正文:一、基因克隆1. 酶切与连接：通过使用特定限制酶对DNA进行切割，然后使用DNA连接酶将不同DNA片段连接起来。
2. DNA片段扩增：利用聚合酶链反应（PCR）扩增目标DNA片段，得到大量复制的目标片段。
3. 质粒构建：将目标基因片段插入质粒中，构建重组质粒，然后将其转化到宿主细菌中。
二、PCR1. 反应体系：PCR反应需要引物、模板DNA、琼脂糖等成分，同时需要在适宜的温度条件下进行。
2. 热循环：PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。
通过不断重复这三个步骤，可以扩增目标DNA序列。
3. PCR变异：通过引入突变引物或特殊PCR反应体系，可以实现目标片段的定向变异。
三、DNA测序1. Sanger测序：利用DNA聚合酶反应合成，以dideoxynucleotide三磷酸（ddNTP）作为终止子，从而得到带有不同长度的DNA片段，再通过毛细管电泳分离，并借助荧光标记的ddNTP定序碱基。
2. 下一代测序：利用高通量测序平台，如Illumina、Ion Torrent等，可以同时测序大量DNA片段，从而加快和降低测序成本。
3. 新一代测序技术的应用：新一代测序技术广泛应用于基因组测序、转录组测序、甲基化测序等领域。
四、基因编辑1. CRISPR-Cas9系统：通过引入Cas9核酸酶和相应的单导RNA（sgRNA），可以实现对目标基因的精准编辑和改造。
2. CRISPR-Cas9应用：基因敲除、基因敲入、基因修饰和基因变异等应用广泛，可以用于研究基因功能和疾病治疗等领域。
3. CRISPR-Cas9技术的优缺点：CRISPR-Cas9技术具有高效、快速和精准编辑基因的优点，但也存在不确定的副作用，如非特异性剪切和细胞毒性等。
分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物精选全文
可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。
本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。
5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。
事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。
因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法细胞分子生物学是指研究细胞内发生的生物分子互作及其调控的学科。
随着生命科学技术的不断发展和完善，许多技术和方法得以应用于细胞分子生物学的研究中。
本文将从多个方面介绍细胞分子生物学研究中常用的技术和方法。
一、基因克隆技术基因克隆技术是一种常用的细胞分子生物学研究方法。
它可以通过将感兴趣的DNA序列插入载体DNA上，构建含有特定目的基因的重组DNA，最终将重组DNA引入宿主细胞中来研究某一基因的生物学功能。
基因克隆技术的核心是重组DNA技术，其中最常用的重组DNA方法包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化及放大等步骤。
特别是在近年来的分子克隆技术中，基因编辑技术的应用使得基因克隆技术更加得到精细化和精确化。
二、蛋白质结构分析技术蛋白质是生物体中极其重要的分子之一，其结构对蛋白质的生物学功能有着至关重要的作用。
蛋白质的功能在很大程度上取决于其三维结构，因此蛋白质结构的研究是细胞分子生物学的重要研究领域。
蛋白质结构分析技术包括X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜等。
其中，X射线晶体学是目前分析蛋白质最为常用的方法之一，其原理是利用X射线的衍射来确认蛋白质的三维结构。
三、荧光素酶标记技术酶标记技术是研究酶在细胞中的分布和功能的重要方法，其中荧光素酶标记技术则成为近年来应用最广泛的方法之一。
荧光素酶由日本学者O. Shimomura于1962年首次发现，可以发出明亮的荧光，被广泛应用于生物学研究中。
目前，荧光素酶标记技术被用来研究蛋白质的定位和运动等生物学过程，其原理是将荧光素酶标记的免疫球蛋白等物质与荧光素底物结合，从而通过荧光显微镜来研究生物分子的动态变化。
四、蛋白质互作筛选技术蛋白质在细胞中的互作是细胞分子生物学研究的重要问题之一。
蛋白质互作筛选技术则可以用来鉴定蛋白质之间的相互作用关系。
目前常见的蛋白质互作筛选技术包括酵母双杂交法、共免疫共沉淀、荧光共聚焦显微镜等。
分子生物学实验技术分类
分子生物学实验技术分类分子生物学实验技术是现代生物学研究中不可或缺的一部分，它涉及到对生物体内分子结构、功能和相互作用的研究。
这些实验技术在基础科学研究、医学诊断和药物研发等领域发挥着重要作用。
在分子生物学实验技术中，根据其应用和原理可以进行分类，主要包括以下几类：1. 基因克隆技术，基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它包括DNA片段的定向克隆、质粒构建、DNA序列分析等。
通过基因克隆技术，研究人员可以将感兴趣的基因或DNA片段放入适当的载体中，进行进一步的研究和应用。
2. 蛋白质分离和纯化技术，蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构和功能的研究对于理解生物学过程至关重要。
蛋白质分离和纯化技术包括凝胶电泳、亲和层析、离子交换层析等方法，可以将混合的蛋白质样品分离并得到纯净的蛋白质。
3. 核酸分离和检测技术，核酸是生物体内的遗传物质，包括DNA和RNA。
核酸分离和检测技术包括DNA/RNA提取、聚合酶链式反应（PCR）、原位杂交等方法，可以用于检测和分析生物体内的核酸序列。
4. 基因组学和转录组学技术，基因组学和转录组学技术是对生物体内所有基因组和转录组的研究，包括全基因组测序、RNA测序、ChIP-seq等方法，可以帮助研究人员全面了解生物体内基因的组成和表达模式。
5. 蛋白质-核酸相互作用技术，蛋白质和核酸之间的相互作用对于细胞内的生物学过程至关重要。
蛋白质-核酸相互作用技术包括免疫共沉淀、荧光共聚焦、电泳迁移变性等方法，可以帮助研究人员研究蛋白质和核酸之间的相互作用。
以上是分子生物学实验技术的一些分类，这些技术的不断发展和创新为生物学研究提供了强大的工具，也推动了生物医学领域的进步。
在未来，随着技术的不断进步，分子生物学实验技术将继续发挥重要作用，为人类健康和生命科学研究带来更多的突破和进展。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
基因操作的原理和过程
基因操作的原理和过程基因操作（Genetic engineering）是一种利用基因技术对生物体的遗传物质进行修改和重组的技术手段。
通过基因操作，可以对生物的基因进行剪接、修饰或移除，并向生物中引入新的基因或基因片段，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
基因操作在农业、医学、生物工程等领域都有广泛的应用，它不仅可以提高生物的抗病性、耐性和产量，还可以用于研究基因的功能和调控机制。
基因操作的原理是基于对生物体的基因组进行修改和优化，具体分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：首先需要确定要操作的基因，可以是现有生物体中的某个基因，也可以是外源基因。
有时也会选择修改某个特定区域的基因片段。
2. 基因克隆和构建载体：利用分子生物学技术，将目标基因从生物体中分离提取。
然后，将目标基因插入到载体DNA中，构建成重组载体。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化目标细胞：将构建好的重组载体导入到目标细胞中。
可以通过多种途径实现细胞的转化，如化学转化、电转化、冷冻复苏等。
4. 基因表达和筛选：在转化成功后，目标基因会在细胞内进行表达，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
为了筛选出表达目标基因的细胞，可以在重组载体中引入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
5. 验证和分析：在筛选出表达目标基因的细胞后，需要对其进行验证和分析。
可以通过PCR、酶切、同源重组等技术手段来验证基因操作的结果，并进一步分析基因的功能。
基因操作的过程中有一些关键技术和工具，如PCR技术、限制性内切酶、连接酶、DNA测序等。
这些技术和工具的应用使得基因操作的过程更加高效、准确。
基因操作的应用领域广泛，涉及农业、医学、生物工程等多个领域。
在农业领域，基因操作可以用于改良农作物的品质和产量，提高抗病虫害的能力，延长保存期限等。
比如，通过引入抗病虫害基因，使植物对害虫和病毒的侵害产生免疫反应。
在医学领域，基因操作可以用于治疗遗传性疾病、癌症等疾病。
比如，通过修正患者的遗传突变，可以恢复正常的基因功能。
分子生物学中的重要技术方法
分子生物学中的重要技术方法分子生物学是研究生命分子机制的分支学科，是研究生命最小单位--分子的学科。
随着科技的不断发展，分子生物学中的技术不断更新，成为该领域研究不可缺少的工具。
本文将介绍分子生物学中的一些重要技术方法。
一、PCR技术PCR技术（Polymerase chain reaction）是一种通过体外扩增DNA序列的技术，是分子生物学领域中最重要的技术之一。
PCR 技术通过使用DNA聚合酶复制DNA片段，从而以指数级别扩增DNA，可以为后续的实验提供大量的DNA材料。
PCR技术的应用范围很广，包括基因定位、基因分型、基因克隆、基因转染等方面。
二、Western blotting技术Western blotting技术是一种常用的蛋白质检测方法。
它通过电泳将目标蛋白质从蛋白质混合物中分离出来，然后使用抗体检测目标蛋白质。
Western blotting技术可以检测蛋白质的表达水平以及定性，可以在研究蛋白质功能、蛋白质信号传导、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用。
三、DNA测序技术DNA测序技术是一种检测DNA序列的技术。
DNA测序技术可以快速高效地对DNA进行测序，帮助研究者快速确定DNA序列，对基因组学、遗传学等领域的研究起到了至关重要的作用。
目前，主要的DNA测序技术有Sanger测序技术和下一代测序技术两种。
四、RNAi技术RNAi技术（RNA interference）是通过寡核苷酸干扰RNA打断特定的信使RNA从而靶向沉默目标基因的技术。
RNAi技术通过设计和合成RNA小分子干扰RNA（siRNA），可以沉默目标基因、进行基因功能验证、研究基因调控等方面发挥重要作用。
五、CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种新型的基因编辑技术，通过指导RNA与Cas9蛋白共同识别和切割DNA，实现特定基因的切除、插入、修饰等操作。
CRISPR-Cas9技术是一种高效、简便、精准的基因编辑技术，可以用于植物学、动物学、微生物学等领域的研究，也是治疗基因遗传性疾病的有力工具。
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Triton-溶菌酶法
质粒DNA提取方法的选择
• 常用的碱裂解法,煮沸法，SDS法均可 获得较满意效果．至于有人采用碱裂解 法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸 法或SDS法进行质粒DNA的大量分离， 只 是各个实验室的习惯问题.
质粒提取的主要方法
• 碱裂解法：
原理：基于染色体DNA与质粒DNA的 变性与复性的差异而达到分离目 的.细菌在强碱性环境中裂解， 蛋白质变性，染色体DNA被蛋白 质包裹缠绕，质粒DNA被释放出 来。
1 保证核酸一级结构的完整性； （pH 4～10；0 ～4℃;机械剪力；核酸酶等）
2 尽量排除其他分子的污染,保证提取核酸的纯度;
1)其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应 降低到最低程度； 2)核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的
有机溶剂和过高浓度的金属离子； 3)其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
质
粒
标记基因
结
构
图
抗性基因
多克隆位点 启始复制子
质粒DNA的提取和纯化
• 质粒的分离与提取则是最常用、最基本的 实验技术． 1、细菌的培养
• 主要步骤： 2、细菌的收集与裂解 3、分离纯化
质粒提取的主要方法
质粒DNA的小量制备
2-5ml
质粒DNA的大量制备
500ml
碱裂解法
方法
煮沸法
SDS裂解法
浓度：
DNA双链:
1 OD ~
DNA单链或RNA: 1 OD ~
寡核苷算单链: 1 OD ~
纯度：
A260/280之比应在1.80
50 µg 40 µg 33 µg
只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
NanoDrop ND-1000 spectrophotometer.
2. 荧光光度法 NanoDrop® ND-3300 Fluorospectrometer
凝胶电泳法：
BIO－RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统
ImageQuant RT ECL 凝胶成像系统
核酸的贮存——DNA保存
1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于1×TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反 应，PH低于7.0时DNA容易变性。
• 质粒：质粒是染色体以外能自身独立复制的超 螺旋共价闭环双链DNA分子。
• 能自主复制，是能独立复制的复制子。 • 质粒能携带外源基因进入细菌中扩增或表达.是
基因工程中广泛应用的基因运载工具. • 常见质粒载体
pUC： pUC 119， pUC 118， pUC 18, pUC 19，T—载体 pBR：322，327
酶切片段
DNA序列分析
探针标记 分子杂交技术 生物信息学
分子生物学技术
第一节 核酸的提取与鉴定概述
核酸分子抽提的技术路线的设计
1、核酸的释放：
破裂细胞
释放核酸
机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法）
2、核酸的分离与纯化：
• 将含有核酸分子从复杂复合物或他物质分离中
分离
提取DNA总的原则
2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效 防止细菌和核酸的污染。
核酸的贮存——RNA保存
• Rnase InhibitorRNA酶抑制剂Human Placental ribonuclease inhibitor（HPRI）是一种蛋白质，可与多种 RNA酶（包括RNases A, B, C类）非共价结合成为等摩尔复 合物，抑制RNA酶活性。
• RNA可溶于DEPC水（焦碳酸二乙酯）中，在-70℃保存。 • RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-
20℃保存。
分子生物学技术
第二节 质粒DNA的提取
Plasmid DNA Preparation
• 质粒的基本概念 • 质粒提取的原理和方法 • 质粒的纯化
质粒DNA的提取
主要内容
一、常用分子生物学技术： • 质粒DNA的提取 • 基因组DNA/RNA的提取 • 核酸的纯化、分离及定量 • 聚合酶链式反应（PCR） • DNA序列分析 • 核酸杂交技术 二、其他分子生物学技术：
主要技术
质粒DNA提取
DNA/RNA的提取
纯化、分离及定量
限制性酶切技术
DNA合成 聚合酶链式反应（PCR）
3 EB荧光分析法
荧光染料溴化乙锭(EB)，可嵌入到碱基平面， 而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于半定量分析。
完整性鉴定
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢， 如果发生降解，可出现电泳图谱脱 尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量， 提示是否存在RNA降解；如加样槽 中存在条带，可能是DNA污染。
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
• 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 • 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂
（如乙醇、异丙醇等） • 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
细胞
Bacterial Cells Or tissue culture cells Or blood Or flies………..
基因操作（Gene manipulation）
分子生物学常用技术
The Popular Technology in Molecular Biology
分子生物学研究目标——生物大分子
DNA RNA 蛋白质
操作对象：
DNA
核酸
制备
RNA
分析
蛋白质
操作
以核酸为主要对象来讲述
分子生物学技术
分离
分析
操作
抽提 有机抽提法
纯化DNA
鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
1、荧光光度法
2、紫外分光光度法
DNA OD260/280=1.8 RNA OD260/280=2.0
浓度与纯度鉴定
1 紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。
如计算DNA浓度：
A260×稀释倍数×50＝ μg/ml
特点：操作简单、成本低、产量高、 要方法
• 煮沸裂解法
原理：
加热可使蛋白质和染色体DNA变 性，但环状质粒DNA结构紧密而 不会解链，温度下降后，质粒 DNA又重新恢复超螺旋结构。通 过离心去除变性的蛋白质和染色 体DNA，回收上清液中质粒DNA。
特点：煮沸裂解法比较剧烈，只用 于提取小质粒。对于会释放出大 量糖类的菌株(HB101)不适宜.