液相色谱溶剂效应
高效液相色谱
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
溶剂概述和溶剂效应
溶剂概述和溶剂效应摘要：对化学反应中溶剂的种类和作用做概述，以及溶剂效应在紫外，荧光，红外，核磁波谱和液相色谱中的作用。
关键词：溶剂溶剂效应吸收光谱液相色谱1，溶剂1.1溶剂的定义溶剂是一种可以溶化固体，液体或气体溶质的液体，继而成为溶液，最常用的溶剂是水。
1.2溶剂的分类溶剂按化学组成分为有机溶剂和无机溶剂有机溶剂是一大类在生活和生产中广泛应用的有机化合物，分子量不大，常温下呈液态。
有机溶剂包括多类物质，如链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等等，多数对人体有一定毒性。
（本文主要概述有机溶剂在化学反应以及波谱中的应用）2，溶剂效应2.1溶剂效应的定义溶剂效应是指溶剂对于反应速率，平衡甚至反应机理的影响。
溶剂对化学反应速率常数的影响依赖于溶剂化反应分子和相应溶剂化过渡态的相对稳定性。
2.2溶剂效应在紫外，荧光，红外，核磁中的应用2.2.1溶剂效应在紫外吸收光谱中的应用[5]有机化合物紫外吸收光谱的吸收带波长和吸收强度，与所采用的溶剂有密切关系。
通常，溶剂的极性可以引起谱带形状的变化。
一般在气态或者非极性溶剂（如正己烷）中，尚能观察到振动跃迁的精细结构。
但是改为极性溶剂后，由于溶剂与溶质分子的相互作用增强，使谱带的精细结构变得模糊，以至完全消失成为平滑的吸收谱带。
这一现象称为溶剂效应。
例如，苯酚在正庚烷溶液中显示振动跃迁的精细结构，而在乙醇溶液中，苯酚的吸收带几乎变得平滑的曲线，如图所示2.2.1.1溶剂极性对n→π*跃迁谱带的影响[2]n→π*跃迁的吸收谱带随溶剂的极性的增大而向蓝移。
一般来说，从以环己烷为溶剂改为以乙醇为溶剂，会使该谱带蓝移7nm：如改为以极性更大的水为溶剂，则将蓝移8nm。
增大溶剂的极性会使n→π*跃迁吸收谱带蓝移的原因如下：会发生n→π*跃迁的分子，都含有非键电子。
例如C=O在基态时碳氧键极化成Cδ+=Oδ-，当n电子跃迁到π*分子轨道时，氧的电子转移到碳上，使得羰基的激发态的极性减小，即Cδ+=Oδ-（基态)→C=O（激发态）。
高效液相色谱流动相
高效液相色谱流动相高效液相色谱的流动相(Mobile Phase)液相色谱流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。
与气相色谱相比较，液相色谱流动相不仅可选择范围比较大，而且它是影响分离的一个非常重要的可调节因素。
在实际工作中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。
一、流动相溶剂的选择高效液相色谱中所选用的流动相溶剂必须能保证该色谱系统的分离过程可重复进行:溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求;溶剂应当不干扰检测器的工作;在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。
从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。
对液相色谱溶剂的要求: 1)溶剂要有一定的化学稳定性, 不与固定相和样品组分起反应。
2)溶剂应与检测器匹配，不影响检测器正常工作。
3)溶剂对样品要有足够的溶解能力，以提高检测灵敏度。
4) 溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。
5) 溶剂的沸点低，有利于制备色谱的样品回收。
液相色谱流动相溶剂的选择步骤选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等选择合适洗脱强度的溶剂:简单样品，2 ? k'? 5;复杂样品，0.5 ? k'? 20 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的α值二、表征溶剂特性的重要参数 1)溶剂沸点、分子量、相对密度、介电常数、偶极距、折射指数、紫外吸收截止波长、与液相色谱分离密切相关的最重要的溶剂特性参数是溶剂强度参数?? ，溶解度参数?? ，极性参数P'和粘度η。
2) 溶剂洗脱强度溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力。
在吸附色谱中, "溶剂洗脱强度"与溶剂极性成正比;而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。
在液相色谱常用混合溶剂作流动相。
混合溶剂的P'具有加和性: P'ab= ??aP'a，?? bP'b , ??为某一溶剂的体积分数。
液相色谱分析中常见问题及其解决方法
六通阀的示意图
色谱柱系统的故障
柱温箱的温度控制失灵 系统和保留时间压力改变， 色谱柱堵塞 系统压力升高 色谱柱柱效下降或色谱柱损坏 样品出峰时间改变，峰形变坏，分离效果 变差
检测器
检测器的类型 紫外或二极管阵列检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器
紫外/可见光检测器的光路系统， 氘灯提供190nm～600nm 紫外/可见光检测器的光路系统，由氘灯提供190nm～600nm 宽带光谱，光线径直射到全息凹面光栅上 宽带光谱，光线径直射到全息凹面光栅上，衍射的单色光射到 半透射反光镜，被分成两束光线，一束经流通池后照射到测量 半透射反光镜，被分成两束光线，一束经流通池后照射到测量 光电池上，另一束经参比池照射到参比光电池上， 光电池上，另一束经参比池照射到参比光电池上，光电池把光 能量转换成微小电流信号， 能量转换成微小电流信号，光栅由一台微机控制的步进电机精 确地驱动以改变波长。 确地驱动以改变波长。如图所示：
泵头有气泡 排气 进口阀或出口阀失灵 超声清洗或更换 系统泄露 用了错误的流动相或流动相比例不对 用了错误的色谱柱 色谱柱或保护柱或混合过滤器有堵塞的现象 色谱柱的柱温不对 压力模块出现故障，通常是压力传感器或仪器主板的问题
基线问题 （一）基线的漂移
光源的未完全稳定，解决方法：延长仪器预热时间， 流动相的比例在变化，和色谱柱之间未达到化学平衡，延 长平衡时间 环境温度在变化 保持恒温 色谱柱或流通池被污染
基线问题 （二）基线的噪声
电信号噪音 特征： ①很均匀密集的毛刺，光源能量过低或者光路污染，更换光 源或清洗光路，仪器接地不良 ②突然出现的无规则的脉冲式尖锐信号，且与流动相流速无 关，仪器的电路板的问题，检查仪器接地情况或者报修
液相色谱仪工作原理液相色谱概述
液相色谱仪工作原理液相色谱概述012009-09-02 18:44:46| 分类：分析仪器 | 标签：色谱优化 e名京人液色迷人液相色谱专家|字号大中小订阅岛津shimadzu的液相色谱概述01液色迷人的液相色谱概述01液相色谱仪工作原理一、液相色谱仪－高压输液系统输液系统由贮液罐、过滤器、梯度洗脱装置、高压输液泵、脱气装置等组成。
高压泵是高效液相色谱仪最重要的部件之一。
由于高效液相色谱仪所用色谱柱直径细，固定相粒度小，流动相阻力大，因此，必须借助于高压泵使流动相以较快的速度流过色谱这。
高压泵需要满足以下条件：能提供150－450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；耐腐蚀。
目前所用的高压泵有机械泵和气动放大泵两种。
梯度淋洗装置可以将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以达到提高分离效果，缩短分离时间的目的。
梯度淋洗的作用与气相色谱中的程序升温装置类似。
（一）贮液罐贮液罐为不锈钢、玻璃或氟塑料制成的容器，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
贮液罐可以是一个普通的溶剂瓶，也可以是一个专门设计的储液器。
储液器往往和泵通过管路构成循环系统以便除去溶剂中的气体。
现多数使用溶剂瓶，一般采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
（二）高压输液泵气相色谱由高压钢瓶直接提供动力，高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，是流动相的动力源。
高压输液泵功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
液相色谱为了获得高柱效，所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压输液泵。
1.对高压输液泵的要求（1）能在高压下连续工作，一般要求耐压40～50MPa·cm2，能在8～24 h连续工作。
液相色谱常见问题
2. Nortriptyline
4. Imipramine 丙米嗪 5. Amitriptyline 阿米替林
3. Doxepin 6. Trimipramine
Tailing Eclipse XDB-C8
USP TF 拖尾因子
High Load / 10 Low Load
高载负/10倍
低载负
1. 1.60
A. Injection Solvent 100% Acetonitrile 峰形宽拖尾
B. Injection Solvent Mobile Phase 峰形尖锐对称
样品溶剂尽可能与流动相匹配
二、峰形问题-裂峰
原因的确定
复杂样品的基质或分析许多样品 柱污染或部分阻塞滤片
流动相 pH>=7 硅胶溶解使柱塌陷(除非使用专门的柱子)
溶剂比流动相的可能性大 裂峰和宽峰,由样品量来决定
二、峰形问题-峰拖尾、变宽和柱效降低
可能的原因
•
• 柱“次级效应” • 柱塌陷 • 柱污染 • 柱老化 • 柱负荷超载 • 柱外效应
二、峰形问题-峰拖尾柱“次级效应”
Column: Alkyl-C8, 4.6 × 150mm, 5µm
Mobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 15%ACN Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35ºC
Sample:
1. 苯丙醇胺／去甲麻黄碱 2. 麻黄碱 4. 脱氧麻黄碱 5. 苯三胺
无三乙胺
USP TF(5%) 美国药典拖尾因子 因子
3. 安非他明／苯丙胺
10 mM 三乙胺 USP TF(5%) 美国药典拖尾
1. 1.29
液相色谱分离的溶剂效应
液相色谱分离的溶剂效应“溶剂效应”会致使哪些峰形异样？如何幸免溶剂效应？在HPLC分析中样品溶剂的选择和流动相是如何的联系？为何建议利用流动相溶解样品？。
一系列的问题都和样品溶剂的选择紧密相关，如何解决真正的溶剂效应问题，又如何分辨哪些是非溶剂效应问题，不同的问题有不同的解决方式，有哪些先辈留下的实战体会可供分享呢？一路来看看吧！什么是溶剂效应?样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会造成的峰展宽、峰分叉现象。
即色谱图上较早洗脱的峰前沿或开叉，与此同时较晚洗脱的峰那么较为正常的现象。
例如样品溶液的溶剂是100%乙腈（100%的强溶剂），而流动相的组成那么较弱，18%的乙腈与72%的水。
第一个峰是开叉的，而且与第二个峰相较，明显地变宽了。
当样品溶液的溶剂变成流动相时，所有的峰形都改善了，且变得尖锐。
可能发生溶剂效应的情形：●出峰时刻早；●保留弱；●进样量大。
用流动相溶解样品能够取得专门好的峰形当溶解样品的溶剂不同于流动相时，样品溶剂与流动相发生混合，样品溶剂被冲稀。
若是进样溶剂之强度高于流动相，样品在刹时会表现为在较强溶剂中，并以较快速度通过色谱柱。
表此刻色谱图上确实是∶色谱峰的保留时刻缩短。
`当进样溶剂与流动相混合时，一部份分子会先与流动相混合，致使这些分子通过色谱柱的速度发生转变，使峰形扭曲，发生变形。
洗脱较早的色谱峰峰变形要比洗脱晚的色谱峰严峻。
解决进样溶剂问题的关键是使进样体积足够小，如此稀释进程会超级快；或利用比流动相弱的溶剂溶解样品。
较弱的溶剂会使样品在色谱柱上发生浓缩，在某些情形下，色谱峰会比利用较强溶剂时窄一些。
因此，在通常情形下，若是溶解样品的溶剂比流动相强，进样体积应不高于25mL。
进样体积大小与进样溶剂与流动相之间的不同大小有关。
这一不同很容易凭体会取得∶慢慢加大进样体积，直至发生峰变形现象。
采纳比发生峰变形时小一些的进样体积即可。
问题中发生的峰变形确实是因为溶解样品的溶剂甲醇强度远远高于流动相，因此取得了变形的、展宽的峰。
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进样体积对色谱行为的影响பைடு நூலகம்
当样品溶剂不同于流动相时，进样体积对色谱行为影响较为显著。
当样品用流动相溶解时，进样体积对色谱行为影响较小。
消除溶剂效应的方法
尽量用与流动相比例相同或相近的溶剂溶解样品。 对于梯度洗脱，采用初始的流动相比例。 对于在流动相中溶解度小，必须用强溶剂时，减少进样体积以
目录
案例分享 溶剂强度对色谱行为的影响 进样体积对色谱行为的影响 消除溶剂效应的方法
格列吡嗪含量均匀度分析方法 色谱柱：Waters Nova-Pak C-18， 150*3.9mm,4um 进样量：20uL 波长：225nm 流速：1.0mL/min 流动相：甲醇：PH6.0磷酸盐缓冲液=45:55
作稀释剂时，色谱峰面积不稳定，峰面积重新性较差。 《中国药典》2000年版二 部改为用流动相为稀释剂后，峰面积重新性良好。 电离状态差异，例如样品的稀释剂是pH6.8溶出介质，流动相中缓冲液是pH3.0的 磷酸盐，这就可能发生保留时间不稳定及色谱峰变形的现象。
溶剂强度对色谱行为的影响
溶剂强度顺序
消除溶剂效应的影响
反向色谱中，溶剂强度洗脱顺序为：二氯甲烷＞丙醇＞ 四氢呋喃＞ 乙醇＞ 乙腈＞ 甲醇＞ 水（最弱）。
洗脱能力差异导致的色谱行为差异
样品溶剂强于流动相时，样品溶剂可看成流 动相的一部分，溶解于强溶剂的洗脱带，一 部分样品会被强溶剂迅速洗脱出色谱柱，另 一部分在洗脱过程中溶于流动相，被流动相 洗脱出，这样会造成色谱峰的展宽或分叉。
样品溶剂： 甲醇：磷酸盐缓冲液 =60:40
溶剂效应
什么是溶剂效应？
样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时，可能会造成的峰展宽、峰分叉现象。
溶剂效应的现象
色谱图上较早洗脱的峰前沿或开叉，与此同时较晚洗脱的峰则较为正常。
可能发生溶剂效应的 情况
保留弱，出峰时间早 进样量大 溶解性差异，例如《中国药典》2000年版二部盐酸环丙沙星片含量测定时，用水
样品溶剂： 纯甲醇
样品溶剂： 甲醇：磷酸盐缓冲液=45:55
峰展宽
《中国药典》2010版瑞格列奈左旋异构体液相方法 色谱柱：Chiral AGPTM手性柱，100*4.0mm,5um 进样量：20uL 波长：240nm 流动相A：pH7.0磷酸盐缓冲液 流动相B：乙腈 梯度洗脱：
样品溶剂： 纯甲醇