高效液相色谱中溶剂效应理论
高效液相色谱
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
溶剂概述和溶剂效应
溶剂概述和溶剂效应摘要：对化学反应中溶剂的种类和作用做概述，以及溶剂效应在紫外，荧光，红外，核磁波谱和液相色谱中的作用。
关键词：溶剂溶剂效应吸收光谱液相色谱1，溶剂1.1溶剂的定义溶剂是一种可以溶化固体，液体或气体溶质的液体，继而成为溶液，最常用的溶剂是水。
1.2溶剂的分类溶剂按化学组成分为有机溶剂和无机溶剂有机溶剂是一大类在生活和生产中广泛应用的有机化合物，分子量不大，常温下呈液态。
有机溶剂包括多类物质，如链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等等，多数对人体有一定毒性。
（本文主要概述有机溶剂在化学反应以及波谱中的应用）2，溶剂效应2.1溶剂效应的定义溶剂效应是指溶剂对于反应速率，平衡甚至反应机理的影响。
溶剂对化学反应速率常数的影响依赖于溶剂化反应分子和相应溶剂化过渡态的相对稳定性。
2.2溶剂效应在紫外，荧光，红外，核磁中的应用2.2.1溶剂效应在紫外吸收光谱中的应用[5]有机化合物紫外吸收光谱的吸收带波长和吸收强度，与所采用的溶剂有密切关系。
通常，溶剂的极性可以引起谱带形状的变化。
一般在气态或者非极性溶剂（如正己烷）中，尚能观察到振动跃迁的精细结构。
但是改为极性溶剂后，由于溶剂与溶质分子的相互作用增强，使谱带的精细结构变得模糊，以至完全消失成为平滑的吸收谱带。
这一现象称为溶剂效应。
例如，苯酚在正庚烷溶液中显示振动跃迁的精细结构，而在乙醇溶液中，苯酚的吸收带几乎变得平滑的曲线，如图所示2.2.1.1溶剂极性对n→π*跃迁谱带的影响[2]n→π*跃迁的吸收谱带随溶剂的极性的增大而向蓝移。
一般来说，从以环己烷为溶剂改为以乙醇为溶剂，会使该谱带蓝移7nm：如改为以极性更大的水为溶剂，则将蓝移8nm。
增大溶剂的极性会使n→π*跃迁吸收谱带蓝移的原因如下：会发生n→π*跃迁的分子，都含有非键电子。
例如C=O在基态时碳氧键极化成Cδ+=Oδ-，当n电子跃迁到π*分子轨道时，氧的电子转移到碳上，使得羰基的激发态的极性减小，即Cδ+=Oδ-（基态)→C=O（激发态）。
高效液相溶剂效应
高效液相溶剂效应
高效液相溶剂效应（solvent effect in high-performance liquid chromatography，简称HPLC溶剂效应）是指在高效液相色谱（HPLC）中，流动相（溶剂）对于样品分离和保留的影响。
HPLC是一种广泛应用于分析化学领域的技术，用于分离、检测和定量复杂混合物中的化合物。
在HPLC中，样品溶解在流动相中，经过固定相（色谱柱填料）的分离，不同化合物因其相互作用力的不同而在柱中以不同速率运移。
溶剂效应在HPLC中具有以下几个方面的影响：
1. 保留时间：不同溶剂的性质和极性不同，会影响样品化合物与固定相之间的相互作用，从而影响样品的保留时间。
溶剂效应的变化可能导致不同化合物的保留时间发生变化，进而影响分离效果。
2. 分离效果：溶剂对于分离效果具有重要影响。
不同的溶剂性质和极性会导致不同化合物之间的相互作用力发生变化，影响其在色谱柱中的分离效果。
因此，选择合适的溶剂体系对于获得良好的分离效果非常重要。
3. 色谱峰形状：溶剂的选择也会影响色谱峰的形状。
适当的溶剂选择可以得到对称、尖峰的色谱峰，有助于准确的峰面积和峰高的测定。
为了在HPLC中得到准确、可靠的结果，研究人员通常会进行溶剂的优选和优化。
选择适合的流动相体系，合理调整溶剂的比例和流速，以达到理想的分离效果。
此外，也需要注意不同的化合物可能对溶剂更加敏感，因此在实验设计和分析时需要对样品和溶剂进行充分考虑。
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高效液相色谱分析
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
中国药典版--高效液相色谱法
现象3：基线漂移
判断————————————------------------排除方法 （1）溶剂贮槽污染---------------（1） 清洗贮槽装入新的流动相冲洗柱子 （2）前次分离样品中的强吸附组分 从柱上洗脱-------（2）在分离之前用强 流动相从柱中洗脱所有的组分：使用溶 剂梯度清洗柱子 （3）由微粒造成柱入口、进样阀、 柱入口的部分堵塞--（3）清洗进样系统 和柱入口过滤片
色谱条件与系统适用性试验
按各品种项下的要求对仪器进行适用 性试验，即用规定的对照品对仪器进 行试验和调整，应达到规定的要求； 或规定分析状态下色谱柱的最小理论 板数、分离度、重复性和拖尾因子。
（1） 色谱柱的理论板数
色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入 供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液， 记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰 的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应 取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按 n=5.54(tR／Wh/2)<2>计算色谱柱的理论板数， 如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长， 载体性能，色谱柱充填的优劣等），使理论板 数达到要求。
6最低检测限的意义 最低检测限虽然是个绝对值，但其真正 意义确是相对值，即相对于供試品溶液 的中样品浓度的多少而言，，设定杂质 总量不得过1.0％。最低检出限通常许达 到对照溶液浓度的十分之一到五十分之 一。 7使用对照品外标一点法测定时的关键是 什么 使用对照品外标一点法测定时的关键是 尽量保持样品溶液和对照品溶液的浓度 一致。
（4）泵中有气泡，泵压不稳-----------（4） 赶除聚集于泵头内的气泡 （5）溶剂纯度不高，背景吸收强，透 光差------ -------- -------- （5）提纯溶剂或 选纯度比较高、透光性好的溶剂作为流动 相 （6）检测池污染-------------（6）清洗检 测池 （7）示差折光检测器液槽漏 --------（7）检修或更换液槽
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
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高效液相色谱中溶剂效应理论
高效液相色谱是有机分析，特别是药物分析的重要手段。
而色谱峰峰形影响着化合物的定量和定性。
在影响色谱峰峰形的诸多因素中，“溶剂效应”经常被忽视。
本文是对高效液相色谱中“溶剂效应”的漫谈，水平有限，欢迎批评指正。
高效液相色谱已经广泛应用于有机分析，特别是药物分析工作中。
分析工作者通常将更多精力集中在流动相和仪器方法的选择上，忽视了溶解样品所用溶剂的重要性。
高效液相色谱进样之前，必须选择一种合适的溶剂溶解样品。
如果溶剂选择不当则会产生“溶剂效应”，使分析工作者在定性和定量分析中产生误判，影响分析结果。
因此，了解“溶剂效应”产生的原因及掌握避免“溶剂效应”的基本方法对分析工作者是十分必要的。
溶剂效应的概念
溶剂效应亦称“溶剂化作用”。
指液相反应中，溶剂的物理和化学性质影响反应平衡和反应速度的效应。
可能造成色谱峰展宽、分叉、保留时间漂移、峰面积变化，双峰等现象。
与此同时，较早洗脱的峰出现前沿或分叉，较晚洗脱的峰峰形正常【1】。
溶剂效应产生的原因
样品进入高效液相色谱中，当溶剂与流动相存在差异时，一部分样品溶解进入了流动相，一部分还留在溶剂里,造成色谱保留的差异。
造成这种差异的原因主要有以下几个方面：
（1）溶剂强度
在反相色谱系统中溶剂强度的顺序为水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最强）。
溶解样品的溶剂强度大于该样品出峰时流动相强度，样品溶剂可以看成流动相的一部分，一部分样品溶解于溶剂中会被迅速洗脱出色谱柱，而一部分样品溶解于流动相，被流动相洗脱出，这样会造成色谱峰的展宽或者分叉【2】。
图1是溶剂强度对色谱峰形的影响。
图1 溶剂强度对色谱峰影响[2]
图2是笔者采用AgilentZORBAX TC-C18色谱柱以乙腈-水（30:70）为流
动相，采用不同的溶剂对目标分析物进行处理制备同一浓度的溶液，考察目标分析物的峰面积及峰高。
图2 不同溶剂溶剂效应对比
（2）进样体积
进样体积造成的溶剂效应是一般与溶剂种类有关的。
流动相作为溶剂时，增加进样体积后，目标分析物色谱峰不会发生迁移，保留时间基本稳定。
使用强度大于该样品出峰时流动相强度的溶剂，增加进样体积后，目标分析物色谱峰会向前迁移，直至裂分，并且峰高变小峰宽变大。
这是因为进样体积较小时，扩散至流动相的目标分析物占绝大多数，除了保留时间略微提前，峰形以及峰宽与流动相溶解时基本一致。
体积增大到一定程度，扩散至流动相氛围的目标物与留在溶剂氛围的目标物在数量上相当时，色谱峰分叉明显。
当样品体积进一步增大，绝大多数目标物进入色谱柱时是溶解在溶剂中的，目标分析物的色谱峰已经明显向前迁移了。
常规情况下，为了获得良好的峰形，推荐的进样量为10μL。
不过实际情况中经常会出现20μL、30μL、50μL甚至100μL的进样量，比如痕量物质的定量。
所以如果不能减少至合适的进样体积，为了获得良好的响应和峰形，应尽量选择与流动相比例相同或相近的溶剂。
（3）溶剂与流动相的兼容性
有些样品采用流动相或者流动相中的有机相溶解难度较大，分析工作者会
采用氯仿、乙酸乙酯、苯等溶剂，这些溶剂与流动相兼容性不佳，直接包裹
溶质跳过色谱初期的保留过程，待溶剂的分配平衡建立起来后溶质过于展宽，甚至直接部分冲出色谱柱。
【3】其实在色谱柱中的流动相只有50%是动态，其余50%在死体积、载体间隙处于静止状态。
溶质被固定相吸附先通过50%的“静止区”，若溶剂及流动相不兼容，则影响溶质在溶剂与流动相之间的传递，从而影响被固定相吸附而导致峰形变差。
（4）溶剂pH值
易于解离的化合物对流动相的pH值较敏感。
该化合物处理解离状态下极性
发生显著变化，导致固液分配系数发生较大变化。
该影响经常表现为保留时间的漂移而不是多个峰或者峰分叉等峰形差现象。
导致溶剂效应除了上述原因一般还有溶剂紫外吸收、柱前管路、柱长、离子缔合、互变平衡等。
再此就不做详细叙述。
溶剂效应的判断方法
当出现色谱峰异常时，比如色谱峰分叉，可采用全波长扫描查看分叉色谱峰紫外吸收情况来进行判断。
另外对样品溶液进行低样本量（如0.5μL），若峰形正态基本就可以断定为“溶剂效应”。
溶剂效应的消除方法
应该尽量使用流动相作为溶剂（梯度采用初始比例），可以极大减弱或消除溶剂对色谱行为的影响。
溶剂中的有机相比例略低于流动相有机相比例时峰形更好。
当样品浓度响应较大，可以采用减少进样体积减弱溶剂的影响。
但要酌情而定，比如在有关物质测定时，减少进样量常常会牺牲灵敏度。
当溶剂因标准或者待测成分性质不能改变时，可适当调整流动相比例，使其强度尽量与溶剂接近，从而消除影响。
对于梯度洗脱而言，在不影响分离度的情况下，可以改用较粗内径的柱前管路。
适当的对溶剂进行转换（酸提、碱提、回流酯化或开环、衍生化等）。
适当的对溶剂进行净化（固相萃取、固相分离萃取、液液萃取、GPC净化等）
吸样后，针不回针座，悬停空中，计量泵吸-排-吸-排数次，使目标物完全扩散至流动相。
此条是同行相关经验，并未经笔者验证。
溶剂要求
高纯度：不能与固定相发生反应，溶剂不纯会引起基线变差，产生“伪峰”。
溶剂应该与检测器匹配，溶剂在紫外光条件下应没有吸收或吸收很小。
溶剂对于待测样品具备足够的溶解能力。
溶剂的极性要与待测样品相匹配，如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响纯化分离，且会使柱子恶化。
溶剂化学稳定性良好，不与样品发生聚合反应。
低粘度，沸点适中，减小溶质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效【4】。
常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等；粘度过低的溶剂也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。