睡眠剥夺对小鼠免疫的影响
睡眠剥夺小鼠海马组织氧化应激水平及血红素加氧酶-1表达的研究
【摘要】 目的 研究睡眠剥夺小鼠海马组织的氧化应激水平及血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）表达情况。
方法 采用多平台睡眠剥夺方法在小鼠睡眠剥夺的24 h 、48 h 、72 h 进行取材，检测小鼠海马组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD ）的活性和丙二醛（malondialdehyde ，MDA ）水平，采用半定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction ，RT-PCR ）检测HO-1 mRNA 的表达水平。
结果 睡眠剥夺48 h ，小鼠海马组织SOD 活性显著增强，HO-1 mRNA 表达明显上调；睡眠剥夺72 h ，小鼠海马组织MDA 表达有增高趋势，SOD 活性下降，HO-1 mRNA 仍持续高表达。
结论 睡眠剥夺可影响小鼠海马组织氧化应激水平，且伴随小鼠海马组织HO-1表达上调。
【关键词】 睡眠剥夺；氧化应激；血红素加氧酶-1；超氧化物歧化酶；丙二醛Study on the level of oxidative stress and the expression of heme oxygenase-1 in hippocampus of sleep deprivation miceZhai Lei 1, Chen Jun 2, Feng Zijing 2 (1. Intensive Care Unit, Beijing Bo'ai Hospital, Beijing 100086, China; 2. Laboratory of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China)Correspondingauthor:ZhaiLei,E-mail:***************【Abstract 】 Objective To validate the level of oxidative stress and the expression of heme oxygenase-1 (HO-1) in hippocampus of sleep deprivation mice. Method The activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA) in hippo-campus of mice were detected by multi-platform sleep deprivation method at 24 h, 48 h and 72 h after sleep deprivation, the expr e ssion level of HO-1 mRNA was detected by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Result After 48 h of sleep deprivation, the activity of SOD and the expression of HO-1 mRNA in hippocampus of mice were significantly increased; after 72 h of sleep deprivation, the expression of MDA in hippocampus tended to increase, the activity of SOD decreased, and the expression of HO-1 mRNA remained at a high level. Conclusion Sleep deprivation can affect the level of oxidative stress in the hippocampus of mice, and the expression of HO-1 in the hippocampus of mice is up-regulated.【Key words 】 Sleep deprivation; Oxidative stress; Heme oxygenase-1; Superoxide dismutase; Malondialdehyde睡眠剥夺小鼠海马组织氧化应激水平及血红素加氧酶-1表达的研究翟蕾1，陈珺2，冯子敬2（1．北京博爱医院 ICU ，北京 100086；2．首都医科大学附属北京友谊医院神经内科实验室，北京 100050）通信作者：翟蕾 E-mail ：***************近年文献报道睡眠障碍广泛存在于颅脑损伤患者中，尤其是轻度颅脑损伤患者较常见。
睡眠剥夺对小鼠免疫的影响 共20页
实验预期
1.胸腺指数和脾脏指数的测定
经过一段时间的慢性不完全睡眠剥夺会对 机体免疫功能产生伤害，胸腺和脾脏均会受 到损害，表现为胸腺指数和脾脏指数分别下 降。
96孔微量反应板的清洗
将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板 的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次， 再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。
0.5%红细胞制备方法
先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液 (其量为所需血量的1/5)，从小鼠静脉或心脏 采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌 生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心 10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球， 同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次， 最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成 0.5%小鼠红细胞悬液。
（2）将两组液体移入流式专用管，上流式细胞仪检 测
3.红血球凝集实验
红血球凝集指红细胞凝集的现象。 由病毒、细胞凝集素和抗体而引 起的红细胞凝集。在病毒而引起 的凝集中，如果存在抗病毒的抗 体时，则由病毒引起的凝集作用 将被抑制，所以可用于抗病毒抗 体的检出。
实验准备
器材：96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL 定量移液器，滴头，微型振荡器。
免疫功能的测定
1.
实验准备 器材：滤纸，粗剪刀，婴儿称 对象：第一组实验小鼠
实验步骤
实验步骤： （1）用颈椎脱臼法处死
第一组小鼠并立即称取 体液 （2）解剖摘取小鼠的胸 腺和脾脏，用滤纸吸干 残血后，称重（mg） （3）所得重量分别除以 小鼠体重(g)，再乘以 100％，即分别得到胸腺 指数和脾脏指数。 胸腺指数=（胸腺重量/ 小鼠体重）×10 脾脏指数=（脾脏重量/ 小鼠体重）×10
睡眠剥夺对小鼠学习记忆能力及焦虑行为的影响初探
睡眠剥夺对小鼠学习记忆能力及焦虑行为的影响初探作者：唐子涵来源：《魅力中国》2018年第23期摘要：睡眠对动物的生理活动具有不可忽视的重要作用，睡眠剥夺（sleep deprivation SD）被认为是对动物脑认知能力有明显的损害，但是其具体效果却各有不同的说法。
中华行为医学与脑科学杂志上的《睡眠剥夺对小鼠学习记忆和海马pCREB水平的影响》[1]一文中所用的睡眠剥夺方法是“轻触法”，而本实验所用的睡眠剥夺方法是“转轮法”，并且该文中睡眠剥夺历时三十天，本研究由于学业的紧张，时间不是很充裕，所以只是睡眠剥夺了一天；此外，由于实验设备有限，本研究中所用的迷宫为自制迷宫，多数文献中所用到的检测学习记忆能力的装置都是水迷宫，本研究运用另一种不同的迷宫想要找出其中是否会有差异。
另外，有实验表明，慢性不完全剥夺睡眠导致小鼠的空间学习记忆能力明显下降，出现该结果的原因是动物睡眠剥夺后出现代谢紊乱，这时的脑组织出现慢性缺氧状态，智能活动所需要的血液供应和能量供应相应减少而致使记忆获得功能受损[2]。
本实验通过运用转轮装置完全剥夺睡眠一天观察睡眠剥夺对小鼠学习记忆能力以及焦虑行为的影响，探讨睡眠剥夺对小鼠正常生理活动的影响。
经实验以及对文献的阅读，在本研究中，关注指标分别为小鼠的学习记忆能力和焦虑行为的改变。
本文旨在研究以小鼠受到睡眠剥夺后的身体状况并由此进行推测。
关键词：睡眠剥夺；学习；记忆；焦虑行为引言夜间睡眠对于维持人体的正常生理活动有着极大的作用，作为影响人类日常工作学习的重要因素，“熬夜会对人体产生负面影响”的说法也在社会上广为流传。
尽管负面影响的说法的确与事实相符，而其具体效果却众说纷纭。
身为中学生，身边也有许多同学总是熬夜，第二天在学校的时候就会表现出不同的反应，有些同学认为熬夜对自己的学习生活影响不大，而另外一些同学认为熬夜会很大程度地影响自己第二天的在校的学习生活，在这些人当中有些人认为熬夜直接对自己的学习记忆能力有所影响，还有一些同学认为熬夜对学习生活的不良影响其实是来源于它对人心情的不好的影响，有可能会使我们的情绪低落、心情烦闷，容易急躁。
刺五加增强小鼠睡眠剥夺模型免疫功能和抗疲劳能力的实验研究_许光辉
刺五加增强小鼠睡眠剥夺模型免疫功能 和抗疲劳能力的实验研究
许光辉1 * ，吴艳萍2 ，罗友华1 ，黄亦琦1 ，李廷利3
（ 1. 厦门市医药研究所，福建 厦门 361008； 2. 福建中医药大学药学院，福州 3. 黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040）
350000；
［摘要］ 目的： 探讨刺五加对小鼠睡眠剥夺模型免疫 功 能 和 抗 疲 劳 能 力 的 影 响 。 方 法： 将 小 鼠 随 机 分 为 正 常 对 照 组、模 型组和刺五加低、高剂量组。刺五加低、高剂量组分别按照 500，1 000 mg·kg － 1 的剂量 ig，连续给药 10 d，正常对照组 和 模 型 组 每天 ig 等体积 的 蒸 馏 水。 在 第 11 d，将 模 型 组 和 刺 五 加 低、高 剂 量 组 的 小 鼠 采 用 单 平 台 水 环 境 法 进 行 睡 眠 剥 夺 （ sleep deprivation，SD） ，在 SD 期间，继续给予实验药物。SD 连续 3 d 后，采用炭粒廓清 实 验 观 察 药 物 对 SD 小 鼠 免 疫 功 能 的 影 响，通 过负重游泳实验和转棒疲劳实验观察药物对 SD 小鼠抗疲劳能力的影响。结 果： 炭 粒 廓 清 实 验 中，刺 五 加 500，1 000 mg·kg － 1 的 K 值和 α 值为（ 0. 021 4 ± 0. 008 3，0. 030 7 ± 0. 005 9） ，（ 4. 0 ± 0. 2，4. 6 ± 0. 2） ，与 SD 组相比均显著增加； 抗疲劳实验中，刺 五加 500，1 000 mg·kg － 1 的游泳时间和转棒时间为（ 828 ± 83） ，（ 990 ± 64） S，（ 330 ± 63） ，（ 665 ± 170） s，与 SD 组相比均显著延 长。结论： 刺五加具有增强睡眠剥夺小鼠免疫功能和抗疲劳能力的作用。
过度疲劳对小鼠免疫系统影响的研究
由 （ ２可 知 ） 对照 组小 鼠平 均 ａ 为 ６ ２ ８ ， 验组 平 均 ａ值为 们 观察 到过 度训练 后 的大 鼠神 态倦 怠 ， 表 ， 值 ．６７ 实 眼睛 变 得 暗淡 无光 ， 毛发 脱 落 明 ５２８ ， ． ０ ３ 实验组与对照组相比降低 了 １００ ， ． ６ 无显著性差异（ ＞ ．５ 。 ４ Ｐ ００ ） 显 ＿ ， 结果 和我们 本 次 研究 结 果相 符 合 ， 明过 度 的体 力 运 动 能影 ｌ 此 表 ３ 讨 论 ． 响 小 鼠的一 般健 康状 况 。另 外 ， 本 次研 究 中我们 还 观 察 到 实 验组 小 在 过度疲 劳是由于长期超负荷地进行体力 劳动或脑力劳动 而产生的一种 鼠经常 发生相 互打 斗 、 咬 的现象 ， 撕 这在 以往对 过 度训 练 的 大 鼠或 小 鼠 疲劳状 态， 它能对生物机体各种机能产生不同程度的负面影 响。 的研 究 中是 没有发 现 的 ， 表 明使 小 鼠过度 训 练 的 同 时减 少其 睡 眠 时 这 在 本次 研究 中 ， 我们观 察到 实验 组小 鼠逐 出现神 态倦 怠 ， 欲下 降 ， 间更 能影 响小 鼠 的精神状 况 。 食 毛发蓬 乱枯 槁 ， 明显 脱 落 ， 外 界 刺 激 反应 迟 钝 等疲 劳症 状 。叶剑 且 对 另外 ， 在本次研究中我 们对小 鼠的死亡率 进行 了测定 。结果 发现在 整 飞、 闵、 余 岑浩 望 等 采用 跑 台 的方 法 塑造 过 度 训 练模 型并 对 此 研究 ， 他 个造模过程 中小 鼠不断死亡 ， 的 １ 有 ３只死亡 ， 最多 ｄ 造模结束时死亡率高达
ｓｎ ｒｍ ，ｈｎ ｇｏＧ ｎｇｎ ｉ ｅｇ（ ｈｎＰ ｂｉ Ｈｅｌ ） ２ ０ ， ｙ ｄｏ ｅ Ｚ ｏｇｕ ｏ ｇｏ ｇＷｅｓ ｎ Ｃ ｉ ｕｌ ａｔ ，０ ２ ｌ ｈ ｃ ｈ ８ （ ） １０ ８ ：０ ６—９ ．
银杏叶提取物对睡眠剥夺小鼠学习记忆能力的影响及其机制的研究
银杏叶提取物对睡眠剥夺小鼠学习记忆能力的影响及其机制的研究作者：唐梦晨陈娇徐文杰李凌来源：《中国当代医药》2016年第06期[摘要] 目的研究银杏叶提取物（EGB）对睡眠剥夺小鼠学习记忆能力的影响及其机制。
方法选取成年健康清洁级小鼠48只，雌雄各半，根据随机数字表法将小鼠随机分为4组（n=12）：空白组，对照组，治疗Ⅰ组，治疗Ⅱ组，适应性饲养3天，每组筛选出9只进行造模。
应用72 h睡眠剥夺法制作动物模型，用Y迷宫成绩（正确反应次数）评定学习记忆能力，免疫组织化学法反映小鼠海马脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白表达。
结果 Y迷宫测试结果显示，给药后，对照组与治疗Ⅰ组、对照组与治疗Ⅱ组的正确反应次数差异有统计学意义（P0.05）。
与对照组比较，空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组海马区的BDNF表达增高，其灰度值差异有统计学意义（P0.05）。
结论睡眠剥夺能造成脑损伤、学习记忆能力减退以及BDNF表达减少，EGB可能是通过上调BDNF蛋白及其相关通路蛋白改善睡眠剥小鼠的学习记忆能力。
[关键词] 银杏叶提取物；睡眠剥夺；脑源性神经营养因子；学习记忆[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）02（c）-0004-04[Abstract] Objective To study the influence extract of Ginkgo biloba （EGB） on learning and memory ability in sleep-deprivation mice and its mechanism. Methods Forty-eight healthy and clean adult mice were selected，half male and half female，and they were evenly divided into 4 groups according to the random number table method：blank group，control group，treatment groupⅠ，and treatment group Ⅱ，and they were given adaptive feeding for 3 days，9 mice were selected in each group to make model.72-hour of sleep-deprivation method model was applied.The learning and memory ability was evaluated by achievement of Y maze.The protein expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampal area in mice was reflected by immunohistochemistry. Results Test result of Y maze showed that，after administration，there was a statistical difference of right reaction times between control group and treatment groupⅠ，and between control group and treatment groupⅡ（P0.05）.Compared with control group，BDNF expression of hippocampal area in blank group，treatment group Ⅰ，and treatment group Ⅱ was improved，and there was a statistical difference of gray value （P0.05）. Conclusion Sleep-derivation can lead to cerebral damage，decreased learning and memory ability，and reduction of BDNF expression，and EGB may improve learning and memory in sleep-deprivation mice by up-regulating BDNF protein and its related pathway protein.[Key words] Extract of Ginkgo biloba；Sleep-deprivation；Brain-derived neurotrophic factor；Learning and memory睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）一般指在24 h中的睡眠银杏叶提取物（extract of Ginkgo biloba，EGB）已被国内外用于改善脑功能不全患者的学习记忆能力，是一种“认知增强剂”[7]。
睡眠剥夺实验实验报告
一、实验目的1. 了解睡眠剥夺对生物体的影响。
2. 探究睡眠剥夺对小鼠生理和心理状态的影响。
3. 分析睡眠剥夺对小鼠免疫系统的影响。
二、实验方法1. 实验动物：选用健康、体重相近的小鼠30只，随机分为3组，每组10只。
2. 实验分组：A组：正常睡眠组，小鼠在正常睡眠环境中生活；B组：短期睡眠剥夺组，小鼠睡眠剥夺时间为48小时；C组：长期睡眠剥夺组，小鼠睡眠剥夺时间为96小时。
3. 实验操作：（1）A组：保持小鼠在正常睡眠环境中生活，记录其睡眠时间和睡眠质量。
（2）B组：将小鼠置于无光、无噪音的环境中，限制其睡眠时间为48小时，期间提供充足的食物和水。
（3）C组：将小鼠置于无光、无噪音的环境中，限制其睡眠时间为96小时，期间提供充足的食物和水。
4. 实验指标：（1）生理指标：观察小鼠的体重、心率、体温等生理指标的变化。
（2）心理指标：通过观察小鼠的行为、情绪等心理指标的变化，评估睡眠剥夺对小鼠心理状态的影响。
（3）免疫系统指标：检测小鼠血液中的细胞因子水平，评估睡眠剥夺对小鼠免疫系统的影响。
三、实验结果1. 生理指标：（1）A组：小鼠体重、心率、体温等生理指标基本稳定；（2）B组：小鼠体重略有下降，心率加快，体温略有升高；（3）C组：小鼠体重明显下降，心率明显加快，体温明显升高。
2. 心理指标：（1）A组：小鼠行为正常，情绪稳定；（2）B组：小鼠表现出焦虑、紧张等情绪，活动量增加；（3）C组：小鼠出现明显的抑郁、焦虑、攻击性等情绪，活动量减少。
3. 免疫系统指标：（1）A组：小鼠血液中细胞因子水平基本稳定；（2）B组：小鼠血液中细胞因子水平略有升高；（3）C组：小鼠血液中细胞因子水平明显升高，出现细胞因子风暴。
四、实验分析1. 睡眠剥夺对小鼠生理指标的影响：睡眠剥夺会导致小鼠体重下降、心率加快、体温升高，表明睡眠剥夺对小鼠的生理状态有不良影响。
2. 睡眠剥夺对小鼠心理指标的影响：睡眠剥夺会导致小鼠出现焦虑、紧张、抑郁、攻击性等情绪，表明睡眠剥夺对小鼠的心理状态有不良影响。
小鼠睡眠剥夺实验报告
小鼠睡眠剥夺实验报告引言睡眠是人类和动物生活中不可或缺的一部分，对于维持身体健康和精神状态有着重要作用。
过去的研究表明，长时间的睡眠剥夺会导致一系列不良影响，包括认知功能下降、情绪紊乱和免疫力下降等。
为了更深入地研究睡眠对生命活动的影响，我们进行了一项小鼠睡眠剥夺实验。
实验目的1. 探究睡眠剥夺对小鼠行为和认知能力的影响；2. 研究睡眠剥夺对小鼠免疫系统的影响；3. 分析睡眠剥夺对小鼠的生理指标的影响。
实验方法实验动物我们选择了健康体态的雄性C57BL/6小鼠作为实验对象，年龄在8-10周之间。
实验组和对照组我们将小鼠随机分为实验组和对照组。
实验组进行睡眠剥夺处理，对照组则保持正常的睡眠状态。
每组各有10只小鼠。
睡眠剥夺处理实验组小鼠被放置在特制的循环运动盘中，通过连续旋转使其无法入睡。
此处理每天持续8小时，共进行连续7天。
行为和认知能力测试在实验结束后，我们使用开放区域测试和Y字迷宫测试来评估小鼠的行为和认知能力。
开放区域测试中，我们记录小鼠在新环境下的活动范围和活动时间。
Y字迷宫测试中，我们观察小鼠探索迷宫并记忆之前的路径。
免疫系统评估我们采集实验组和对照组小鼠的血液样本，通过检测细胞免疫指标（如白细胞计数和淋巴细胞活性）来评估其免疫系统的功能状态。
生理指标测量我们测量了实验组和对照组小鼠的体重变化、体温变化和血压变化，以评估睡眠剥夺对其生理指标的影响。
实验结果行为和认知能力实验组小鼠在开放区域测试中表现出更高的活动范围和活动时间，而对照组小鼠较为保守。
在Y字迷宫测试中，实验组小鼠探索迷宫的时间较长，并能更好地记忆之前的路径，而对照组小鼠则表现出较差的表现。
免疫系统评估实验组小鼠的白细胞计数和淋巴细胞活性较对照组小鼠明显下降，表明睡眠剥夺可能导致免疫功能下降。
生理指标测量实验组小鼠的体重变化、体温变化和血压变化与对照组小鼠相比没有明显的差异。
讨论与结论通过睡眠剥夺实验，我们发现长时间的睡眠剥夺会对小鼠的行为和认知能力产生影响，并可能导致免疫系统的功能下降。
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对照组
实验组
用特定病毒抗 原对两组小鼠 进行免疫，一 定的时间后抽 取小鼠血液制 成血清滴在反 应板上，用特 定病毒进行滴 加，观察血液 凝剂情况并记 录
对已经免疫的A 组小鼠进行不同 程度的睡眠剥夺， B组不做睡眠剥 夺，然后对实验 小鼠进行上述血 凝操作，观察血 凝情况
96孔微量反应板的清洗
睡眠剥夺对小鼠 免疫能力的影响
主讲人：辛凯悦 指导老师：朱艳媚
组员：杜晨阳、辛凯悦、 李毅、朱灵凤、舒文静
动物模型的建立
统计 正文 参考文献
研究对象
睡眠剥夺对小鼠 免疫能力的影响
免疫功能测定
讨论
实验预期
研究目的
睡眠是一种生理现象，睡眠 充足与否与人体健康有着密 切联系。长期睡眠剥夺可引 起人或动物产生不良情绪反 应、免疫功能下降等等。随 着生活节奏的加快，越来越 多的儿童与成年面临睡眠不 足的危害，这已足够引起人 们的注意。本小组通过一种 慢性不完全剥夺小鼠睡眠实 验来观察睡眠不足对小鼠免 疫功能的影响。
3.红血球凝集实验 在反应板上可以直观地观察到：对照组红细 胞不凝集，在反应板的微孔中红细胞沉底呈 点状，经过免疫的小鼠体内产生较多的抗体， 可以与加入的流感病毒反应而抑制鸡血红细 胞的凝集作用；实验组的红细胞凝集，在反 应板的微孔中平铺呈网状，即经过睡眠剥夺 的小鼠免疫能力会下降，产生的流感病毒抗 体减少，流感病毒与鸡血红细胞产生凝集作 用要强于对照组。
睡眠剥夺是指由于某种原因导致的睡眠数量被迫减 少，它对机体的影响是十分明显的。它可以造成机 体疲劳、作业能力降低、免疫力下降、警觉水平降 低，并引起情绪改变、精神不振、粗心、注意力不 集中、食欲下降、记忆力下降、工作效率低等不良 反应。 不完全睡眠剥夺可导致免疫功能的下降. 机体内过 量的自由基可对机体产生伤害,其重要原因是产生脂 质过氧化物,造成对细胞结构和功能的破坏,从而导 致衰老和各种疾病,机体内超氧化物歧化酶(SOD) 的 功能是清除体内的氧自由基,从而对机体起到保护作 用 ,增强免疫力. 有研究表明,长期睡眠较差的人的 血清过氧化脂质明显偏高,红细胞SOD 活性明显偏低, 从而导致机体免疫力下降.。本实验的预期结果是慢 性不完全睡眠剥夺会对小鼠的免疫器官产生伤害,其 机制可能与上述因素有关。
免疫功能的测定
1.
实验准备 器材：滤纸，粗剪刀，婴儿称 对象：第一组实验小鼠
实验步骤
实验步骤： （1）用颈椎脱臼法处死 第一组小鼠并立即称取 体液 （2）解剖摘取小鼠的胸 腺和脾脏，用滤纸吸干 残血后，称重（mg） （3）所得重量分别除以 小鼠体重(g)，再乘以 100％，即分别得到胸腺 指数和脾脏指数。 胸腺指数=（胸腺重量/ 小鼠体重）×10 脾脏指数=（脾脏重量/ 小鼠体重）×10
组别
动物数量 (n)
胸腺指数 (%)
脾脏指数 (%)
正常对照组 （b组）
10只
睡眠剥夺组 (a组)
10只Байду номын сангаас
2.外周血T淋巴细胞亚群检测
（1）两组小鼠分别自眼底静脉丛取血，肝素抗凝。 吸取抗凝全血100μL，加入预先调制好的FITCCD3\PE-CD4\PE-Cy5-CD8 3种荧光标记抗体混合液 12μL，并设置荧光同型对照。室温避光反应20min, 然后加入红细胞溶解液，每份标本加1ml，混匀，室 温避光10min,见细胞悬液呈亮红色时，说明红细胞 被裂解，再加入含20mL/LFCS的生理盐水，以400g离 心洗涤细胞2次，洗涤后的细胞最终回复到500μL （2）将两组液体移入流式专用管，上流式细胞仪检 测
实验预期
1.胸腺指数和脾脏指数的测定 经过一段时间的慢性不完全睡眠剥夺会对 机体免疫功能产生伤害，胸腺和脾脏均会受 到损害，表现为胸腺指数和脾脏指数分别下 降。 2. 外周血T淋巴细胞亚群检测 睡眠剥夺以后的小鼠体内的T细胞总数将减 少。实验组CD4 +T小宝数量没有明显变化， 而CD8 +T细胞数量均有下降，即杀伤性T细胞 数量减少，导致CD4/CD8明显增大。
动物模型的建立
采用轻触法一、二组对小鼠不完全剥夺睡眠， 每天剥夺睡眠时间从上午六点到下午五点结 束。其中a组、c组是实验组，b组、d组是对 照组。具体方法为：当实验组小鼠出现睡眠 状姿势时，即用毛笔轻触小鼠使其保持清醒 状态，当小鼠处于清醒状态时则不对其进行 任何刺激，在睡眠剥夺过程中，正常对照组 始终可以自由睡眠。一个周睡眠剥夺后，进 行免疫功能的测定。
3.红血球凝集实验
红血球凝集指红细胞凝集的现象。
由病毒、细胞凝集素和抗体而引 起的红细胞凝集。在病毒而引起 的凝集中，如果存在抗病毒的抗 体时，则由病毒引起的凝集作用 将被抑制，所以可用于抗病毒抗 体的检出。
实验准备
器材：96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL 定量移液器，滴头，微型振荡器。 药品：特定病毒抗原，0.5%小鼠红细胞 对象：第二组实验小鼠
研 究 目 的
实验对象——
一组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机 分成a组、b组，即正常对照组和慢性不完全 睡眠剥夺组。 二组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机 分成c组、d组，即正常对照组和慢性不完全 睡眠剥夺组。 三组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机 分成e组、f组，即正常对照组和慢性不完全 睡眠剥夺组。
统计学方法
所有数据均用均数± 标准差表示，各组均数 间的差异显著性用t检验判断。P<0.05表示差 -异具有显著性；p<0.01表示差异非常显著； p<0.001表示差异极显著；p>0.05表示差异不 具有显著性。
参考文献
[1]洪军,马文龙.睡眠剥夺的对策[J].第一军医大学学 报,2001,21(2):152—154 [2]何志恒,印大中.睡眠研究的科学前沿[J].生命科学 研究,2002,6(4):184—187 [3]李洋,谢扬丽,胡志安.感染和免疫反应对睡眠的影 响[J].生理科学进展,2007,38(2):187——190 [4]赵忠新.临床睡眠障碍学[M].上海：第二军医大学 出版社,2003:25—45 [5]丁琳,胡晓波.睡眠剥夺对机体的影响[期刊论文].微 量元素与健康研究,2010(6)
将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板 的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次， 再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。
0.5%红细胞制备方法
先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液 (其量为所需血量的1/5)，从小鼠静脉或心脏 采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌 生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心 10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球， 同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次， 最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成 0.5%小鼠红细胞悬液。