PCR原理及其操作讲解学习
高三生物pcr知识点
高三生物pcr知识点PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、DNA指纹分析等领域。
高三生物学生需要掌握PCR的相关知识点，下面将详细介绍PCR的原理、步骤和应用。
一、PCR原理PCR是一种体外的DNA复制技术，通过在一定温度条件下，利用酶的催化作用使DNA的复制反应反复进行。
PCR主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，将反应体系升温至94-96℃，使DNA双链解链成单链。
这一步骤中，DNA双链断裂，并且其中的氢键被破坏，使得DNA单链解开，形成两个模板链。
2. 退火在变性步骤完成后，将温度降至50-65℃，引入引物（寡核苷酸引物，即引导DNA复制的短链DNA）来与特定DNA序列互补结合。
引物结合于DNA模板的3'端，以提供起始点供DNA合成酶进行反应。
3. 延伸将温度调节至72℃，引入高温下活性较好的DNA合成酶（如Taq聚合酶），使DNA在引物的引导下进行延伸。
在这个步骤中，DNA合成酶从引物的3'端开始向5'端进行合成，合成一个新的DNA链。
通过不断重复这三个步骤，即可获得大量特定DNA片段的复制产物。
二、PCR步骤PCR通常需要以下步骤：1. 反应体系的制备将引物、DNA模板、dNTPs（四个脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液等混合制备反应体系。
2. 变性升温至94-96℃，使DNA双链解链成单链。
3. 退火降温至50-65℃，引入引物与模板DNA互补结合。
4. 延伸升温至72℃，引入聚合酶使DNA链延伸。
5. 反应周期重复2-4步骤多次，通常需要进行25-35个循环，以获得足够的产物。
6. 终止和保存制备PCR产物后，通常会升温至70-80℃，使聚合酶停止合成反应，并保存PCR产物。
三、PCR应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中具有广泛的应用。
1. 基因检测PCR可以被用于检测和分析DNA样本中的特定基因，以了解其表达和突变情况。
PCR技术原理与操作
PCR技术原理与操作PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种常用于分子生物学研究和诊断的技术。
它通过扩增目标DNA片段，从而使其在实验室中具有足够的量进行进一步的分析。
以下将详细介绍PCR技术的原理与操作。
1. 变性（Denaturation）：DNA双链被高温（通常为94-98℃）瞬间加热，使其变性成两条单链DNA。
高温能够在较短时间内破坏氢键，使DNA分子完全解旋。
2. 引物结合（Annealing）：实验室中已知序列的两个DNA引物（小片段），分别与目标DNA序列的两侧配对结合。
温度被调至50-65℃，使引物与目标DNA片段发生特异性结合。
引物仅与目标序列互补配对。
3. 延伸（Extension/elongation）：在DNA引物的3'端，即目标DNA片段的其中一侧，加入DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液，温度保持在65-75℃。
DNA聚合酶及其他反应物共同使目标DNA片段的核苷酸链延伸。
此步骤通常需要1-2分钟。
这三个步骤一起组成了PCR的一个循环，每个循环会使DNA扩增一倍。
通过让PCR循环重复进行，DNA的数量可以快速倍增。
PCR操作步骤：1.实验室准备：-收集所有PCR所需的试剂：模版DNA、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液等。
-搭建一套无菌的实验室工作环境。
-定量测量所有试剂，确保使用正确的质量。
2.PCR反应混合物的制备：-准备PCR反应的混合物：一个典型的PCR反应液包含模版DNA、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液和水。
确保混合物中每种试剂的浓度符合反应所需。
-所有混合物都应在无菌条件下操作，以防止外部DNA污染。
3.PCR反应条件设置：-设置PCR反应条件，包括变性、引物结合和延伸的温度和时间。
这些条件应根据目标DNA片段的特性来确定。
-通常，PCR反应以94-98℃开始进行变性，然后降低温度以便引物结合，最后使温度上升以使延伸发生。
PCR的原理和操作步骤有哪些方法进行分析
PCR的原理和操作步骤有哪些方法进行分析PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种基因分析技术，通过扩增DNA片段以实现基因检测和分析。
它广泛应用于医学、农业、环境科学等领域。
本文将介绍PCR的原理和操作步骤。
原理PCR的原理基于DNA的复制机制，通过不断复制目标DNA片段，使其数量呈指数增长。
这种复制过程需要酶的介入，主要涉及三个步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：将DNA双链分离为两条单链。
这一步需要高温（通常是94-98°C），以破坏氢键使双链解开。
这样，我们可以得到两条单链DNA。
2.退火（Annealing）：将引物（primers）与目标DNA序列互补配对。
引物是短的DNA片段，可以选择性地结合目标序列。
这一步发生在较低的温度下（通常在50-65°C），以保证引物与目标DNA序列结合。
3.延伸（Extension）：通过DNA聚合酶的作用在引物的两侧合成新的DNA链。
DNA聚合酶以引物为起始点，向着DNA链的3’端合成新的DNA链。
这一步需要较高的温度（通常在72°C），以确保DNA聚合酶的最佳活性。
通过这三个步骤的循环重复，可以在短时间内扩增目标DNA片段。
操作步骤PCR的操作步骤主要包括制备反应体系、设置PCR程序和结果分析。
1.制备反应体系：PCR反应体系由DNA样本、引物、酶和缓冲液等组成。
首先，将目标DNA片段、引物和其他所需试剂按照一定比例加入试管中。
然后，将反应体系混匀。
2.设置PCR程序：PCR反应需要一定的温度和时间调控。
通常需要设置反应的温度曲线和时间参数。
这些参数包括变性温度、退火温度、延伸温度和循环次数等。
通过合理设置PCR程序，可以确保反应的特异性和高效性。
3.结果分析：PCR反应完成后，可以通过凝胶电泳等技术来分析PCR产物。
凝胶电泳可以根据PCR产物的大小来判断是否扩增成功。
PCR技术基本原理及主要步骤
PCR技术基本原理及主要步骤引言PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在生物学和医学领域广泛应用的分子生物技术。
PCR技术通过体外扩增DNA的方法，使得带有目标序列的DNA片段在数小时内被扩增到数百万到数十亿个拷贝，从而使得微量DNA样品得以大规模扩增和分析，具有极高的灵敏度和选择性。
PCR技术基本原理PCR技术基于DNA的体外扩增原理，主要包括三个步骤：变性、扩增和延伸。
1.变性（Denaturation）：将PCR反应液中的DNA双链分离成两条单链DNA。
这一步通常在94-98摄氏度下进行，使用高温能够破坏DNA分子之间的氢键，使DNA 解链。
2.扩增（Annealing）：将反应温度降低至50-68摄氏度，使引物（primer）能够与DNA模板的目标序列特异性结合，引物是两段DNA序列，其中一段与目标序列互补。
引物能够特异性地结合在目标序列的两端，从而产生合适的起始位点。
3.延伸（Extension）：在同一反应体系中加入DNA聚合酶（DNA polymerase），DNA polymerase能够根据引物的特异结合，将双链DNA的失配区域进行聚合。
在72摄氏度时，DNA polymerase以引物为模板进行DNA链的延伸，形成新的DNA 双链。
这三个步骤组成了PCR的一个循环，每一个循环会产生两倍于前一个循环的DNA。
多次循环后，目标DNA序列会被大量扩增，达到检测和分析的要求。
PCR技术主要步骤PCR技术的主要步骤包括DNA样品制备、PCR反应体系配置、PCR反应条件设定、PCR扩增后处理和PCR产物分析等。
1.DNA样品制备：从目标生物体中提取DNA样品。
常见的样品来源包括血液、细胞、组织等。
提取DNA样品时，需要注意使用无菌操作，并使用合适的提取试剂盒进行DNA纯化。
2.PCR反应体系配置：根据需要扩增的目标序列大小和模板DNA浓度，合理配置PCR反应体系。
pcr技术的原理和步骤
PCR技术的原理和步骤一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它在许多领域中具有广泛的应用。
PCR技术的核心原理是通过体外复制DNA，使得我们能够从微量DNA样本中扩增出足够的DNA量进行后续分析。
本文将详细介绍PCR技术的原理和步骤。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理主要基于DNA的复制与扩增过程，它包含以下三个重要步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，DNA模板被加热到95°C，使其两个DNA链分离。
这一步骤被称为变性，它破坏了氢键，使DNA双链变为单链。
变性是PCR技术的起始步骤，确保反应中的DNA单链能够被其他反应物所利用。
2. 退火在变性之后，温度降至50-60°C，引物加入PCR反应体系中与单链DNA互补配对。
引物是短的寡聚核苷酸序列，其中一个与DNA模板的一个单链区段互补，另一个与DNA模板的相对应的区段互补。
引物在退火温度下与DNA单链形成氢键，稳定地结合在DNA模板上。
3. 延伸在退火的温度下，酶聚合酶（Taq polymerase）被加入反应中，它能以引物为起始点，在DNA模板上合成互补链。
Taq polymerase是从一种热水生产的细菌中分离得到的，它能耐受高温，因此可以在PCR反应过程中保持活性。
Taq polymerase能够扩增DNA，其DNA合成速度约为每分钟1000个核苷酸。
PCR技术涉及多个步骤，包括DNA提取、反应体系的准备、PCR反应的设置和PCR产物的分析。
1. DNA提取PCR反应需要DNA作为模板。
DNA可以从多种样本中提取，如血液、组织、细胞培养物等。
DNA提取的方法有多种，包括使用商业DNA提取试剂盒或自行制备DNA提取试剂。
2. 反应体系的准备PCR反应体系通常包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和二硫苏糖醇（DMSO）等。
引物的浓度通常为0.2-0.5 μM，聚合酶的浓度为1-2.5 U/μL。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
PCR的原理和操作过程
原则旳PCR反应体系
10X 扩增缓冲液： 5μl
模板DNA:
0.1~2μg
引物：
各0.2~1μmol/L
4种dNTP: 各200μmol/L
Mg2+:
1.5mmol/L
Taq DNA聚合酶： 2.5U
ddH2O 总体积：
补齐 50μl
能够按照百分比放大或者缩小体系，不同旳PCR反应需要优 化
2. 能从100万个细胞中检出一种靶细胞
3. 病毒检测旳敏捷度可达3个RFU 4. 细菌检测旳最小检出率为3个细菌
1. 简便、迅速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完毕扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本旳纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织旳粗提DNA
第二节 PCR旳试验环节
按照试验方案进行即可
1.加样 将上述总体积为50чl旳反应体系加入一无菌
0.5ml离心管中
2离心 将加入旳反应物混合均匀后稍离心，加入一
滴矿物油覆盖于反应混合物上
3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（详细数据根
据引物和扩增片段旳大小而定）：94℃下加热4分钟左右 ；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟 ，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充 分
PCR原理和基本操作过程
临床146生化试验小组
第一节 PCR技术原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)是一种DNA体外核 酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量旳目旳基因或某DNA片段扩增 至十万乃至百万倍，从极微量旳标本中扩增出足量旳DNA供分析研究和检 测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、迅速、简便、反复性好、易 自动化等突出优点。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于生物学研究和基因工程领域的技术，它能在体外复制目标DNA段，并在短时间内扩增出大量的目标DNA。
本文将详细介绍PCR扩增的原理和操作步骤。
一、PCR扩增的原理PCR扩增是通过DNA聚合酶的酶活性，在体外模拟DNA的复制过程，快速合成大量特定序列的方法。
其原理包括三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
1.1 变性PCR反应开始时，将待扩增模板DNA加热至95℃，使其发生变性，将DNA双链解开成两条单链。
该步骤使DNA变得单链化，为后续的引物结合和DNA合成提供条件。
1.2 引物结合通过降低反应温度至40-60℃，使引物与DNA单链结合。
引物是两个互补的寡核苷酸序列，在扩增过程中所选择的引物，将确定扩增的目标DNA段。
引物与目标DNA序列互补结合，形成引物／DNA复合物。
1.3 延伸升高反应温度至72℃，加入热稳定的DNA聚合酶，启动延伸步骤。
DNA聚合酶以引物为起始点，向延伸方向沿着模板DNA链合成互补的新DNA链。
此步骤的重复进行，将目标DNA段扩增为大量的复制产物。
二、PCR扩增的操作步骤2.1 材料准备准备PCR反应体系所需的试剂和设备，包括DNA样品、引物、酶、缓冲液、dNTPs、镁离子、试管、PCR仪等。
2.2 PCR反应体系的配置根据需要扩增的目标DNA片段的大小和特点，选择适当的引物浓度和配比。
一般情况下，将试管中的反应体系按以下顺序依次配制：缓冲液、dNTPs、MgCl2、引物、DNA模板、聚合酶、去离子水。
2.3 反应条件设置设置PCR反应条件，包括退火温度、延伸时间等。
这些参数的设定与目标DNA的GC含量、长度等相关。
2.4 PCR反应的进行将装有反应体系的试管放入PCR仪中，根据所设定的程序进行PCR扩增反应。
一般情况下，PCR反应包括预变性（变性阶段）、循环扩增（引物结合和延伸阶段）和最终延伸。
2.5 PCR产物分析将PCR反应体系取出，利用琼脂糖凝胶电泳等方法进行PCR产物的分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR的基本步骤
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本步骤
• 1.变性：高温使双链DNA解离形成单 链（94℃，30s）。
• 2.退火：低温下，引物与模板DNA互 补区结合（55℃，30s）。
• 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化 以引物为起始点的DNA链延伸反应 （70～72℃，30～60s）
2n 递 增 （ n 为 循 环 次 数 ） ， 25 ～ 30 循 环 ， 目 标 DNA 可 增 加109倍。
实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的 实际扩增率，平均约为75%。
由 于 引 物 和 底 物 的 消 耗 ， 酶 活 力 的 下降等因素，扩增产物的增加，逐渐 由指数形式变为线性形式，所以实际 上进行30个循环后，扩增倍数一般可 达106～107。
以上“变性、退火、延伸”三部曲 为PCR一轮循环。
PCR扩增曲线
PCR反应五要素 • 1. 引物（primer） • 2. 酶 （Taq DNA polymerase） • 3. dNTP
（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
• 4. 模板 （template） • 5. Mg2+ （magnesium）
– dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活
– dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的 缓 冲 液 将 其 pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解
– 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔 配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几 种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过 低又会降低PCR产物的产量
临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解 病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直 接用于PCR扩增；
RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止 RNase降解RNA
5.Mg2+浓度
• Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有 显著的影响;
• 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200µmol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜;
PCR反应原理及其操作
生物化工 韩栋
1.PCR的基本原理 2.PCR反应体系 3.PCR的基本步骤 4.PCR反应五要素 5. PCR 的反应流程
PCR反应体系
• 4种dNTP混合物 • 引物 • 模板DNA • Taq DNA聚合酶 • Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
形成二聚体的机会
2 .酶及其浓度
目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： – 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 – 基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总 反应体积为100µl时）；
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少。
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：
G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以 上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； ④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的 互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； ⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的 酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； ⑧引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产生所需要的 结果为好 —引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间
• Mg2+浓度过高，反应特异性降低， 出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产 物减少。
PCR 的反应流程
1. 温度与时间的设置 2. 循环次数
1、温度与时间的设置
• 设置变性-退火-延伸三个温度点
• 标准反应中采用三温度点法，双链 DNA在90～95℃变性，再迅速冷却 至40～60℃退火，然后快速升温至 70～75℃延伸，
1.引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。理论上，只要知 道任何一段模板DNA序列，就能按 其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩 增。
引物设计的原则
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，
– dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降
4.模板（靶基因target gene）
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；
传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标 本；
– SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合 而沉淀； – 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇 或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
PCR的基本步骤
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
DNA 2
形
成 条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍
DNA单链
与引物复性
22 DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
高温变性
低温退火
中温延伸
PCR 每 一 步 的 转 换 通 过 温 度 的 改 变 控 制 。 DNA 模 板 解 链 （ 变 性 ） 、 引 物 与 模 板 结 合 （ 退 火 ） 、 DNA 聚 合 酶 催 化 新 生 DNA 的 合 成 （ 延 伸 ） 三 个步骤构成PCR反应的一个循环。