非发酵菌的检验(实验)
dl第二十一章 非发酵菌及检验
分离培养
BAP、SS、MAC
鉴定
初步鉴定（菌落、菌体特征，色素、氧化酶、 KIA），最后鉴定（系统生化、血清学）
药敏试验
粪便
胸腹水 离心 脑脊液 沉淀 尿液 分泌物 血液 （增菌） 体液
分离培养 （SS、MAC）
可 疑 菌 落 初 步 鉴 定
不动杆菌属
不动杆菌属（Acinetobater）为一群不发酵
糖类、氧化酶 - 、无动力的革兰阴性杆菌。 生化反应：氧化酶 - ，MIU - - - ，硝酸盐 还原试验 - 。 耐药性：对全部氨基青霉素、一代二代头 孢菌素和一代喹诺酮类抗生素天然耐药。
鲍曼不动杆菌在BAP上的生长现象
4 2 1
O-F
1
DNA
结果 总值
O
+ + — 6
+ — + 5
+ — — 4
鉴定值：1654
鉴定结果：铜绿假单胞菌
嗜麦芽窄食假单胞菌
嗜麦芽窄食假单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）为条件致病菌，常引起抵抗力
低下患者的各种感染，在假单胞菌的感染 中检出率仅次于铜绿假单胞菌。 生化反应特殊：氧化酶 - ；赖氨酸脱羧酶 +； 氧化分解麦芽糖；水解七叶苷。 耐药性：含有-内酰氨酶，对亚胺培南天然 耐药，临床治疗首选磺胺类（TMP/SMZ）； 喹诺酮类：环丙沙星或替卡西林/克拉维酸。
铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）是假单胞
菌属的代表菌种，为条件致病菌，是医院 感染的主要病原菌。可经多种感染途径、 污染导致多种感染，且对多种抗生素天然 耐药，因此有很重要的临床意义。
临床检验技师-微生物检验(2019)讲义第二十章_不发酵菌及检验
第二十章不发酵菌及检验（不发酵G-杆菌）本章内容概述假单胞菌属（一）铜绿假单胞菌（二）嗜麦芽窄食单胞菌不动杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、莫拉菌属军团菌属不发酵菌概述不发酵或仅氧化形式利用葡萄糖的革兰阴性无芽胞杆菌；大部分为专性需氧菌。
包括13个属。
大多为条件致病菌。
除不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及个别假单胞菌外，氧化酶试验均为阳性。
氧化-发酵（O-F）试验是确定非发酵菌与发酵菌以及测定非发酵菌是否利用糖的基本试验。
麦康凯琼脂上：假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等生长，而莫拉菌属和艾肯菌属等不生长。
假单胞菌属铜绿假单胞菌——生物学特性形态与结构形态：细长杆菌。
染色：G-。
特殊结构：无芽胞，无荚膜。
有1～3根鞭毛，运动活泼。
培养特性营养要求：不高。
气体环境：专性需氧。
温度环境：最适35℃，4℃不生长。
菌落特点：普通琼脂平板：圆形大小不一，边缘不整齐、扁平、隆起、光滑湿润且常呈融合状态的菌落。
血液琼脂平板：扁平、湿润、有特殊气味的灰绿色或蓝绿色菌落，有金属光泽；周围有透明溶血环。
选择培养基：（麦康凯琼脂培养基）微小无光泽半透明菌落，48h菌落中心常呈棕绿色。
（SS琼脂培养基）类似沙门菌的菌落，稍久菌落可呈棕绿色。
产生的主要色素：①绿脓素，为蓝绿色，无荧光性；②绿色荧光素。
铜绿假单胞菌——微生物检验及鉴定标本采集：根据病情采集相应的临床标本。
形态学检查分离培养：依据菌落特征、色素（约10%菌株不产生色素）、气味等以及涂片染色结果。
生化试验（鉴定）耐药性具有多重耐药。
初代敏感的菌株在治疗3～4d后可能发生耐药。
亚胺培南耐药主要原因之一是产生金属酶。
铜绿假单胞菌——致病性及临床意义俗称绿脓杆菌。
是医院感染的主要病原体之一。
引起的局部感染常见于烧伤或创伤后，亦可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，甚至引起心内膜炎、肺炎，严重者可引起败血症，死亡率甚高。
假单胞菌属嗜麦芽窄食单胞菌革兰阴性杆菌。
端鞭毛1～8根，有动力、无芽胞、无荚膜。
非发酵菌的测定实验报告
一、实验目的1. 掌握非发酵菌的基本概念及分类；2. 熟悉非发酵菌的鉴定方法；3. 提高实验室操作技能，培养科学思维和严谨的工作态度。
二、实验原理非发酵菌是一类不发酵或不分解糖类的革兰氏阴性杆菌，主要包括假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。
非发酵菌的鉴定主要通过观察菌落特征、进行生化试验、动力与鞭毛观察等手段。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）非发酵菌菌种：假单胞菌、不动杆菌、产碱杆菌、莫拉菌、黄杆菌等；（2）培养基：普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、动力半固体培养基、氧化酶试验培养基等；（3）试剂：葡萄糖、乳糖、酵母提取物、酚红指示剂、氧化酶试剂等；（4）实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、无菌操作台等。
2. 实验仪器：（1）显微镜：用于观察菌落特征；（2）恒温培养箱：用于培养菌种；（3）酒精灯：用于无菌操作；（4）无菌操作台：用于无菌操作。
四、实验方法与步骤1. 菌落观察（1）将菌种接种于普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，分别于30℃、37℃培养24小时；（2）观察菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘、表面、透明度等；（3）记录观察结果。
2. 动力与鞭毛观察（1）将菌种接种于动力半固体培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种在半固体培养基中的生长情况，如是否有鞭毛、菌落是否呈指状、螺旋状等；（3）记录观察结果。
3. 氧化酶试验（1）将菌种接种于氧化酶试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生氧化酶，即菌落周围是否出现绿色；（3）记录观察结果。
4. 氧化-发酵（O/F）试验（1）将菌种接种于氧化-发酵试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生酸，即菌落周围是否出现红色；（3）记录观察结果。
5. 麦康凯琼脂平板生长情况（1）将菌种接种于麦康凯琼脂平板，30℃培养24小时；（2）观察菌种在麦康凯琼脂平板上的生长情况，如是否生长、生长速度等；（3）记录观察结果。
非发酵菌及检验
窄食单胞菌属(Stenotrophmonas) 土壤杆菌属
丛毛单胞菌属(Comamonas)
金氏杆菌属(Kingella) 食酸菌属（Acidovorax）
莫拉菌属(Moraxella)
鉴定系统
非发酵菌生化鉴定系统
假单胞菌属
(Pseudomonas)
一、分类 P335
假单胞菌属包括200多个菌种，尤以铜绿假单 胞菌（P.aeruginosa）多见。 恶臭假单胞菌生物变种(P.putica biovars)
• 非发酵革兰阴性菌（非发酵菌）的概念、
二、细菌特性
1. 形态染色
革兰阴性杆菌， 多为球杆状，单个存
在或成双排列，无芽
胞，无鞭毛，粘液型
菌株有荚膜。
2. 培养特性
专性需氧，营养要求不高，最 适生长温度为37℃，但有些 菌株可在42℃生长。 血琼脂平板：菌落圆形、光滑、 边缘整齐、灰白色，多数菌 株不溶血，有些β溶血。
麦康凯琼脂平板：菌落呈粉红 色，但在SS琼脂培养基上只 有部分菌株生长。
四、微生物学检验
胸水、血液 血清间接荧光 抗体染色、 ELISA等 气管分泌物和肺、肝、脾组织 分离培养 BCYE或BCYE＋抗生素 血琼脂平板、巧克力琼脂平板 35℃ 2.5%CO2 24h生长 （非军团菌） 48h后生长 革兰染色 姬美耐染色 革兰阴性菌 革兰阳性菌 非军团菌 直接荧光抗体 PCR、DNA探针 双相培养基 BCYE 增菌培养
3. 生化反应
氧化酶－
O/F试验为氧化型（O）
硝酸盐还原试验－
三、临床意义
条件致病菌，医院感染的常见病
原菌。
可从各种临床标本如血液、尿液、
脓液、呼吸道分泌物及脑脊液等
非发酵菌 微生物学检验
非发酵G-杆菌(nonfermentative G- Bacilli)1. 非发酵菌是一群需氧、无芽孢、不利用糖或仅能氧化分解糖类是做为能量来源的G-杆菌。
（1）通常所讲的非发酵菌指在KIA中24小时内表面能够生长，在底部不生长的需氧G-杆菌。
（2）非发酵菌与其它苛养或非糖发酵的G-杆菌之间的界限只是传统意义上的，并不是根据明确的遗传或表型特点来划分。
（3）多为条件致病菌，近年来日益增多，尤其是医院感染。
2. 分类与命名：主要的非发酵G-杆菌属被分成6个科：（1）假单胞菌科：根据rRNA-DNA同源性分为5个rRNA群①rRNAⅠ群/假单胞菌属；②rRNAⅡ群/伯克霍尔德菌属；③rRNAⅢ群/丛毛单胞菌属、食酸菌属；④rRNAⅣ群/短波毛单胞菌属；⑤rRNAⅤ群/窄食单胞菌属；⑥其它：鞘氨醇单胞菌属、希瓦菌属等（2）产碱杆菌科：产碱杆菌属；（3）黄杆菌科：华丽杆菌属（4）莫拉菌科：不动杆菌属、莫拉菌属；（5）甲基球菌科；（6）根瘤菌科3. 非发酵菌的基本鉴定要求（1）缺少糖发酵的证据，通常是在KIA或TSI培养基中无酸产生，斜面和底部均呈红色。
（2）氧化酶+（不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、唐菖蒲伯克菌、浅黄华丽单胞菌、栖稻黄素单胞菌-），但并非所有氧化酶+的G-杆菌都是非发酵菌。
（3）麦康凯上生长很差或不生长。
（4）动力：多为+，但多为专性需氧，故半固体培养基中不明显，宜用直接动力观察或染色法。
4. 重要的鉴定试验（1）葡萄糖利用（O/F试验）：O/F培养基:蛋白胨和糖类的比例为1:5而不同于发酵菌的1:2。
（2）氧化酶试验：（3）动力：半固体培养基:应只穿刺培养基顶部4mm，在培养4-6小时后首次观察结果,24和48小时后再次观察结果。
更准确的方法是湿片法和鞭毛染色。
（4）色素形成：非发酵菌可形成多种色素，有助于菌种的鉴定。
（5）硝酸盐还原/产气：将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而释放氮的生化过程。
（6）吲哚试验：需用含色氨酸丰富的培养基，产吲哚黄杆菌、脑膜败血黄杆菌、食酸丛毛单胞菌等+。
实验：非发酵菌的鉴定
－
－ ＋
0
0 100
不动杆菌属主要菌种间的鉴别
醋酸钙 葡萄糖氧化 木糖氧化 乳糖氧化 精氨酸双水解酶 + － ＋ ＋ 鲍曼 + ＋ ＋ ＋ 溶血 琼氏 约翰逊 洛菲 － － ＋ －/＋ － － ＋ － +/－ － +/－ － － ＋ ＋ ＋
鸟氨酸脱羧酶
枸椽酸盐利用 明胶液化 生长温度: 37℃ 41℃ 42℃
实验：非发酵菌的鉴定
实验目的
1.掌握常见非发酵菌的形态、染色特性、生 化反应及鉴定依据； 2.熟悉常见的几种非发酵菌的鉴定程序及鉴 别方法。
器材和试剂
1.菌种：假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌 和窄食单胞菌属细菌； 2.鉴定试验：双糖管，葡萄糖OF管，枸椽 酸盐琼脂，尿素，鸟氨酸、精氨酸、赖氨 酸，明胶、七叶苷，DNA酶，硝酸盐，木 糖，乳糖，蔗糖。
方法：
1.形态观察； 2.菌落观察； 3.生化反应。
常见非发酵菌的鉴定依据
1.铜绿假单胞菌：
＋ ＋ ＋ － ＋/－ 97 97 98 0 85
单端鞭毛（三根以下） 动 力 氧化分解（O-F培养基） 葡萄糖 乳糖、蔗糖 木 糖
氧化酶
赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶
＋
－ ＋
100
0 99
鸟氨酸脱羧酶
＋
＋ － ＋ － －
＋
＋ － ＋ ＋ ＋
－
＋ ＋ ＋ － －
－
－ ＋ ＋ －
－
－ － － －
－
－ － ＋ － －
＋/－ ＋
嗜麦芽窄食单胞菌
氧化酶 动力 明胶 42ﾟC 七叶苷 赖氨酸 – + + +/+ +
微生物学--非发酵菌检验
（二）、微生物特性
❖ G-直或微弯曲杆菌，具有端鞭毛1-8根2根或 多根极端丛鞭毛，有动力，无芽孢。
❖ 该菌专性需氧，营养要求不高，可在普通平 板血平板和MAC上生长。血平板上培养1824小时，形成圆形、光滑、湿润、浅黄色菌 落；培养48小时菌落，可呈黄色、绿色或灰 白色，菌落中心可有变透明的趋势，称为“猫 眼”现象。
光滑、半透明、边缘整 齐不溶血的菌落。
（四）、微生物学检验
鉴定： ❖ 氧化酶阳性 ❖ 触酶阳性 ❖ 无动力 ❖ 不分解任何糖类 ❖ 吲哚试验阴性
（五）、药物敏感试验及结果解释
❖ 对青霉素类敏感 ❖ 对头孢类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖
甙类药物均为敏感 ❖ 脑炎或脑膜炎、脑脓肿应注意药物通过血
脑屏障的问题
（二）、临床意义
❖ 引起眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、 脑脓肿、心包炎、心内膜炎及泌尿生殖系 统炎症
（三）、微生物特性
❖ 革兰阴性球杆菌 ❖ 呈双短链状排列，
具有多形性
（四）、微生物学检验
分离培养： ❖ 营养要求较高 ❖ 生长温度32~35℃ ❖ 血琼脂平板上生长良好 ❖ 针尖大小的圆形凸起、
生物学特性
G-杆菌，无芽孢，无荚膜，多数菌有端鞭毛或 丛鞭毛，专性需氧菌，生长温度范围广，最适 30-37度，普通培养基上可以生长，可产各种水 溶性色素。抵抗力强，多种抗生素耐药。
微生物检验
2.鉴定：氧化分解葡萄糖、产酸不产气，触酶 氧化酶阳性，吲哚 、甲基红、VP阴性。
❖分型
1.噬菌体分型 2.血清分型 3.核糖体分型 4.PFGE分型
（二）、微生物检验
❖ 鉴定：氧化酶（-），明胶液化试验（+）， 七叶苷（+），赖氨酸脱羧酶（+）， 氧化分解葡萄糖。
非发酵菌群的分类鉴定
假单胞菌属 产碱杆菌属 无色杆菌属 土壤杆菌属 端毛菌 假单胞菌属 鞭毛染色 周毛菌 产碱杆菌属，无色杆菌属，土壤杆菌属 O/F O型 无色杆菌属，土壤杆菌属 还原硝酸盐后产气 + — 土壤杆菌属 无色杆菌属 — 产碱杆菌属
第四节、非发酵菌群的属内鉴别
一、假单胞菌属和 寡氧单胞菌属
假单胞菌属属假单胞菌科，该属为严格的专性需 氧的革兰氏阴性杆菌，具有一端鞭毛，无荚膜、 无芽孢。该菌属在自然界中分布广泛，营养要求 不高，氧化酶试验均为阳性，是假单胞菌科的代 表菌属。
氧化酶阴性菌群
不动杆菌属，寡氧单胞菌属，付百日咳鲍特氏菌 动力 + 寡氧单胞菌属 （嗜麦芽寡氧单胞菌） — 不动杆菌属，付百日咳鲍特氏菌 在鲍—金二氏培养基上产 棕色素 麦康凯上生长 — + 不动杆菌属
+ —
付百日咳鲍特氏菌
）、氧化酶阳性菌群的 鉴别
氧化酶阳性菌群
假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属， 支气管败血鲍特氏菌，金氏杆菌属，无色杆菌属， 莫拉氏菌属，艾肯氏菌属，土壤杆菌属。 触酶 + 假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属， 支气管败血鲍特氏菌，无色杆菌属， 莫拉氏菌属，土壤杆菌属 动力 37℃ 18—24 ℃ — + 支气管败血 鲍特氏菌 + + 假单胞菌属 产碱杆菌属 无色杆菌属 土壤杆菌属 + 黄杆菌属 黄色素 — 莫拉氏菌属 — — 黄杆菌属 莫拉氏菌属 弱 F 金氏杆菌属 — 金氏杆菌属， 艾肯氏菌属 O/F — 艾肯氏菌属
绿棕红无 部分黄色 — 黄 —/棕 — — — — — —
+（周毛） O 型
+（周毛） O 型
非发酵菌群 氧化酶 + 假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属， 支气管败血鲍特氏菌，金氏杆菌属， 无色杆菌属，莫拉氏菌属，艾肯氏菌属， 土壤杆菌属。 — 不动杆菌属 寡氧单胞菌属 付百日咳鲍特氏菌
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成都医学院 临床微生物学教研室
目的
❖ 1.掌握非发酵菌的形态、染色性和菌落特征。 ❖ 2.熟悉非发酵菌的主要生化反应。
器材
❖ 接种环、酒精灯、显微镜等
试剂
❖ 革兰染液、氧化酶试剂、非发酵菌编码生化 鉴定管及相关试剂、生理盐水等
标本
❖ 1#标本和2#标本
操作
❖ 1.标本涂片染色镜检 ❖ 2.接种、培养 ❖ 3.生化试验 ❖ （1）氧化酶试验 ❖ （2）非发酵菌编码生化鉴定管
1组 O-F试验 厌需 氧氧
01
2组 氧枸 麦 化橼 芽 酶酸 糖
42 1
3组 精甘木 氨露糖 酸醇
421
4组
硝D乙酸N酰盐 还Fra bibliotekA 酶
胺 酶
原
421